Universalus SYBR GREEN qPCR premiksas (mėlynas)
Katės Nr.: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (pagrįstas dažais) yra išankstinis sprendimas, skirtas 2x realaus laiko kiekybiniam PGR amplifikavimui, pasižymintis dideliu jautrumu ir specifiškumu, mėlynos spalvos ir turintis mėginio pridėjimo sekimo efektą.Pagrindinis komponentas Taq DNR polimerazė naudoja antikūnų karštąjį paleidimą, kad veiksmingai slopintų nespecifinę amplifikaciją dėl pradmenų susiliejimo ruošiant mėginį.Tuo pačiu metu formulė papildo skatinančius veiksnius, kad pagerintų PGR reakcijos amplifikacijos efektyvumą ir suvienodintų genų, turinčių skirtingą GC kiekį (30–70%), amplifikaciją, kad kiekybinė PGR galėtų gauti gerą tiesinį ryšį plačiu kiekybiniu požiūriu. regione.Šiame gaminyje yra specialus ROX Passive Reference Dye, kuris tinka daugeliui qPCR prietaisų.Nebūtina reguliuoti ROX koncentracijos skirtinguose prietaisuose.Norint paruošti reakcijos sistemą amplifikacijai, reikia pridėti tik pradmenis ir šablonus.
Komponentai
Universalus mėlynas qPCR Master Mix
Laikymo sąlygos
Produktas siunčiamas su ledo paketais ir gali būti laikomas -25 ℃ ~ -15 ℃ temperatūroje 18 mėnesių.Laikant ar ruošiant reakcijos sistemą, būtina vengti stiprios šviesos švitinimo.
Specifikacija
| Koncentracija | 2× |
| Aptikimo metodas | SYBR |
| PGR metodas | qPCR |
| Polimerazė | Taq DNR polimerazė |
| Mėginio tipas | DNR |
| Taikymo įranga | Dauguma qPCR prietaisų |
| Produkto tipas | SYBR premiksas, skirtas realaus laiko fluorescencinei kiekybinei PGR |
| Taikyti (paraiška) | Genų ekspresija |
Instrukcijos
1.Reakcijos sistema
| Komponentai | Tūris (μL) | Tūris (μL) | Galutinė koncentracija |
| Universalus SYBR GREEN qPCR premiksas | 25 | 10 | 1× |
| Pirminis gruntas (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| Atvirkštinis gruntas (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| DNR | X | X | |
| ddH2O | iki 50 | iki 20 | - |
[Pastaba]: prieš naudojimą gerai išmaišykite, kad išvengtumėte per daug burbuliukų dėl stipraus purtymo.
a) Pradmenų koncentracija: galutinė pradmenų koncentracija yra 0,2 μmol/L, ją taip pat galima koreguoti nuo 0,1 iki 1,0 μmol/L.
b) Šablono koncentracija: jei šablonas yra neskiestas pradinis cDNR tirpalas, naudojamas tūris neturi viršyti 1/10 viso qPCR reakcijos tūrio.
c) Šablono skiedimas: cDNR pradinį tirpalą rekomenduojama praskiesti 5–10 kartų.Optimalus pridedamo šablono kiekis yra geresnis, kai amplifikacijos būdu gaunama Ct vertė yra 20-30 ciklų.
d) Reakcijos sistema: siekiant užtikrinti tikslinio geno amplifikacijos efektyvumą ir pakartojamumą, rekomenduojama naudoti 20 μL arba 50 μL.
e) Sistemos paruošimas: pasiruoškite itin švariame stende ir naudokite antgalius bei reakcijos vamzdelius be nukleazės likučių;antgalius rekomenduojama naudoti su filtrų kasetėmis.Venkite kryžminio užteršimo ir aerozolio.
2.Reakcijos programa
Standartinė programa
| Ciklo žingsnis | Temp. | Laikas | Ciklai |
| Pradinė denatūracija | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 10 sek | 40 |
| Atkaitinimas / pratęsimas | 60 ℃ | 30 sek.★ | |
| Lydymosi kreivės stadija | Instrumento numatytosios nuostatos | 1 | |
Greita programa
| Ciklo žingsnis | Temp. | Laikas | Ciklai |
| Pradinė denatūracija | 95 ℃ | 30 sek | 1 |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 3 sek | 40 |
| Atkaitinimas / pratęsimas | 60 ℃ | 20 sek.★ | |
| Lydymosi kreivės stadija | Instrumento numatytosios nuostatos | 1 | |
[Pastaba]: Greitoji programa tinka daugumai genų, o standartines programas galima išbandyti atskiriems sudėtingiems antrinės struktūros genams.
a) Atkaitinimo temperatūra ir laikas: koreguokite pagal pradmenų ir tikslinio geno ilgį.
b) Fluorescencinio signalo gavimas (★): nustatykite eksperimentinę procedūrą pagal prietaiso naudojimo instrukcijos reikalavimus.
c) Lydymosi kreivė: Numatytąją prietaiso programą galima naudoti įprastai.
3. Rezultatų analizė
Kiekybiniams eksperimentams reikėjo mažiausiai trijų biologinių pakartojimų.Po reakcijos reikia patvirtinti amplifikacijos kreivę ir lydymosi kreivę.
3.1 Stiprinimo kreivė:
Standartinė stiprinimo kreivė yra S formos.Kiekybinė analizė yra tiksliausia, kai Ct reikšmė nukrenta tarp 20 ir 30. Jei Ct vertė mažesnė nei 10, šabloną reikia atskiesti ir pakartoti tyrimą.Kai Ct vertė yra tarp 30-35, būtina padidinti šablono koncentraciją arba reakcijos sistemos tūrį, kad būtų pagerintas amplifikacijos efektyvumas ir užtikrintas rezultatų analizės tikslumas.Kai Ct reikšmė didesnė nei 35, tyrimo rezultatai negali kiekybiškai išanalizuoti geno ekspresijos, tačiau gali būti naudojami kokybinei analizei.
3.2 Lydymosi kreivė:
Vienintelė lydymosi kreivės smailė rodo, kad reakcijos specifiškumas yra geras ir galima atlikti kiekybinę analizę;jei lydymosi kreivė rodo dvigubas arba daugybines smailes, kiekybinės analizės atlikti negalima.Lydymosi kreivė rodo dvigubas smailes, todėl reikia nuspręsti, ar netikslinė smailė yra pradmenų dimeras, ar nespecifinė amplifikacija DNR agarozės gelio elektroforezės būdu.Jei tai yra pradmenų dimeris, rekomenduojama sumažinti pradmenų koncentraciją arba pertvarkyti pradmenis su dideliu amplifikacijos efektyvumu.Jei tai nespecifinis stiprinimas, padidinkite atkaitinimo temperatūrą arba perkurkite pradmenis specifiškai.
Pastabos
Dėvėkite reikiamas AAP, pvz., laboratorinį chalatą ir pirštines, kad užtikrintumėte savo sveikatą ir saugumą!
Šis produktas skirtas TIK moksliniams tyrimams!
