RTL atvirkštinė transkriptazė
RTL atvirkštinė transkriptazė yra nuo RNR šablono priklausoma DNR polimerazė, kuri neturi 3'→5' egzonukleazės aktyvumo ir turi RNazės H aktyvumą.Šis fermentas gali naudoti RNR kaip šabloną, kad susintetintų komplementarią DNR grandinę, kuri gali būti pritaikyta pirmosios grandinės cDNR sintezei, ypač RT-LAMP (kilpinės izoterminės amplifikacijos).Palyginti su RTL atvirkštine transkriptaze 1.0, jautrumas žymiai pagerėjo, terminis stabilumas yra stipresnis, o reakcija 65 ° C temperatūroje yra stabilesnė.RTL atvirkštinė transkriptazė (be glicerolio) gali būti naudojama ruošiant liofilizuotus preparatus, liofilizuotus RT-LAMP reagentus ir kt.
Vieneto apibrėžimas
Vienas vienetas per 20 minučių 50 °C temperatūroje įtraukia 1 nmol dTTP į rūgštimi nusodinamą medžiagą, naudojant poli(A)•oligo(dT)25 kaip šablono gruntą.
Komponentai
| Komponentas | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL atvirkštinė transkriptazė (be glicerolio) (15 V/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL buferis | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Sandėliavimo būklė
Transportuoti žemesnėje nei 0°C temperatūroje ir laikyti -25°C~-15°C temperatūroje.
Kokybės kontrolė
- Liekamoji veiklaEndonukleazė:50 μL reakcija, kurioje yra 1 μg λDNR ir 15 vienetų RTL2.0, inkubuota 16 valandų 37 ℃ temperatūroje, rodo tą patį modelį kaip ir neigiama kontrolė gelio elektroforeze.
- Liekamoji veiklaEgzonukleazė:50 μL reakcija, kurioje yra 1 μg HindⅢ suardytos λDNR ir 15 vienetų RTL2.0, inkubuota 16 valandų 37 ℃ temperatūroje, rodo tą patį modelį kaip ir neigiama kontrolė gelio elektroforeze.
- Liekamoji veiklaNikasė:50 μL reakcija, kurioje yra 1 μg superspiralinio pBR322 ir 15 vienetų RTL2.0, inkubuota 4 valandas 37 °C temperatūroje, rodo tą patį modelį kaip ir neigiama kontrolė gelio elektroforeze.
- Liekamoji veiklaRNazė:10 μL reakcija, kurioje yra 0,48 μg MS2 RNR ir 15 vienetų RTL2.0, inkubuota 4 valandas 37 °C temperatūroje, rodo tą patį modelį kaip ir neigiama kontrolė gelio elektroforeze.
- E. coli gDNR:Išmatuota suE.colispecifiniai HCD aptikimo rinkiniai, 15 vienetų RTL2.0 yra mažiau nei 1E. coligenomo.
Reakcijos sąranka
cDNR sintezės protokolas
| Komponentai | Apimtis |
| Šablono RNR a | neprivaloma |
| Oligo(dT) 18-25 (50uM) arba Random Primer mišinys (60uM) | 2 μl |
| dNTP mišinys (kiekvienas po 10 mM) | 1 μl |
| Rnazės inhibitorius (40 U/ul) | 0,5 μl |
| RTL atvirkštinė transkriptazė 2.0 (15 U/ul) | 0,5 μl |
| 10 × HC RTL buferis | 2 μl |
| Vanduo be branduolių | Iki 20 μl |
Pastabos:
1) Rekomenduojama bendros RNR dozė yra 1ng ~ 1μg
2) Rekomenduojama mRNR dozė buvo 50–100 ng
Termo-važiavimas dviračiu Įprastos sąlygos reakcija:
| Temperatūra (°C) | Laikas |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Pastabos:
1) Jei naudojamas Random Primer Mix, inkubavimas 25 °C temperatūroje.
2) Jei naudojamas tikslinis pradmenų mišinys, inkubavimas 55 °C temperatūroje 10–30 min.
RT-LAMP protokolas
| Komponentai | Apimtis | Galutinė koncentracija |
| Šablono RNR | neprivaloma | ≥10 kopijų |
| dNTP mišinys (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| FIP / BIP pradmenys (25 ×) | 1 μl | 1,6 μM |
| F3 / B3 gruntai (25 ×) | 1 μl | 0,2 μM |
| „LoopF“ / „LoopB“ pradmenys (25 ×) | 1 μl | 0,4 μM |
| Rnazės inhibitorius (40 V/μL) | 0,5 μl | 20 U / reakcija |
| RTL atvirkštinė transkriptazė 2.0 (15 U/μL) | 0,5 μl | 7,5 U / reakcija |
| Bst V2 DNR polimerazė (8 U/μL) | 1 μl | 8 U / reakcija |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (iš viso 8 mM) |
| 10 × HC RTL buferis (arba 10 × HC Bst V2 buferis) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Vanduo be branduolių | Iki 25 μl | - |
Pastabos:
1) Sumaišykite maišydami ir trumpai centrifuguokite, kad surinktumėte.Inkubuojama pastovioje temperatūroje 65°C 1 valandą.
2) Du buferiai yra sąveikūs ir jų sudėtis yra tokia pati.
Pastabos
1. Laikant -20 °C temperatūroje šis produktas sudarys baltą kietą medžiagą.Išimkite iš -20°C ir padėkite ant ledo apie 10 minučių.Išsilydžius galima naudoti purtant ir maišant.
2. KDNR produktas gali būti laikomas -20 °C arba -80 °C temperatūroje arba nedelsiant naudojamas PGR reakcijai.
3. Kad išvengtumėte RNazės užteršimo, laikykite eksperimentinę zoną švarią ir darbo metu mūvėkite švarias pirštines ir kaukes.
