Augalų tiesioginis PGR rinkinys
Katės Nr.: HCR2020A
„Plant Direct PCR“ rinkinys tinka tiesioginiam augalų lapų, sėklų ir kt. amplifikavimui, gali būti naudojamas didelio našumo augalų mėginių, kuriuose nėra polisacharidų ir polifenolių, atrankai.Tiesioginės amplifikacijos DNR polimerazė, pagrįsta nukreipta evoliucija, pasižymi geresne tolerancija augalų PGR inhibitoriams.Tuo tarpu jis išlaiko aukštą amplifikacijos efektyvumą, kuris yra tinkamas DNR fragmentų amplifikacijai 5 kb.Komplekte esantis unikalus lizės buferis A gali būti naudojamas šviežiems arba šaldytiems augalų audiniams lizuoti.Jį lengva valdyti, o lizatas gali būti naudojamas kaip šablonas amplifikacijai be gryninimo.Sistemoje yra apsauginių medžiagų, kurios leidžia efektyviai sustiprinti neapdorotus mėginius po pakartotinio užšaldymo ir atšildymo.2 × „Plant Direct Master Mix“ tereikia pridėti pradmenų ir šablonų, kad būtų atlikta amplifikacijos reakcija, taip sumažinant pipetavimo operacijas ir pagerinant aptikimo našumą bei rezultatų atkuriamumą.
Komponentai
| Komponentai | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Augalų tiesioginės lizės buferis A | 5 ml | 20 ml |
| Augalų tiesioginės lizės buferis B* | 5 ml | 20 ml |
*Augalų tiesioginės lizės buferis B yra neprivalomas reagentas, naudojamas augalų tiesioginės lizės buferiui A neutralizuoti, siekiant pailginti mėginių laikymo laiką.Jis gali būti naudojamas atsižvelgiant į faktinę situaciją.
Laikymo sąlygos
2 × Plant Direct Master Mix, laikykite -30 ~ -15 ℃ temperatūroje ir venkite pakartotinio užšaldymo ir atšildymo;Pasodinkite tiesioginės lizės buferį, laikykite -30 ~ -15 ℃ arba 2 ~ 8 ℃ temperatūroje.
Eksperimento procesas
Mėginių apdorojimas–Augalo Lapas
Tiesioginis metodas:Rekomenduojama naudoti jaunus lapus.Naudokite fiksuoto 0,5–3 mm skersmens skylutes, kad gautumėte mažą ir vienodą mėginį, tada mėginį tiesiogiai įpilkite į PGR sistemą (rekomenduojama 50 μl sistema).Atminkite, kad mėginys yra PGR tirpale, o ne prie mėgintuvėlio sienelės.Jei ilgiems fragmentams ir sudėtingiems mėginiams amplifikuoti naudojamas tiesioginis PGR, mažesnio skersmens (0,5–1 mm) mėginio naudojimas kaip šablonas gali padėti gauti geresnių rezultatų.
Šlifavimo lizės metodas:Rekomenduojama naudoti jaunus lapus.Paimkite nedidelį lapo gabalėlį (apie 1–3 mm skersmens), įdėkite jį į 20 μl „Plant Direct Lysis Buffer Ab“ ir kiek įmanoma sumalkite (šį veiksmą galima atlikti suspaudžiant lapą 100 μl pipetės antgaliu mėginiui sutrinti) .Jei naudojami didesni lapų audinio kiekiai (neviršija 7 mm), skiedimo buferio tūrį padidinkite iki 50 μl.Po to, kai lapai sumalami, tirpalas turėtų pasirodyti žalias.Po trumpo centrifugavimo į PGR sistemą įpilkite 1 μl supernatanto kaip reakcijos šabloną.
Terminės lizės metodas:Rekomenduojama naudoti jaunus lapus.Paimkite nedidelį lapo gabalėlį (apie 1–3 mm skersmens), įdėkite į 20 μl tiesioginės augalinės lizės buferio A ir kaitinkite 95°C temperatūroje 5–10 min.Sunkiai lizuojamiems lapams lizės laikas gali būti atitinkamai pratęstas (ne ilgiau kaip 20 min.).Jei naudojami didesni lapų audinio kiekiai (neviršija 7 mm), skiedimo buferio tūrį padidinkite iki 50 μl.Po kaitinimo trumpai centrifuguokite ir į PGR sistemą įpilkite 1 μl supernatanto kaip reakcijos šablonąb.
Mėginių apdorojimas– Augalų sėklos
Šlifavimo lizės metodas:Skalpeliu išpjaukite 5 mm skersmens sėklas, įpilkite jas į 100 μl tiesioginio augalo lizės buferio A ir sumalkite mėginį pipetės antgaliu ar kitais įrankiais.Trumpai sumaišykite ir palikite kambario temperatūroje 3 – 5 min.Įsitikinkite, kad sėklos mėginys yra panardintas į skiedimo buferį.Po trumpo centrifugavimo į PGR sistemą įpilkite 1 μl supernatanto kaip reakcijos šabloną.
Terminės lizės metodas:Skalpeliu išpjaukite 5 mm skersmens sėklas, įpilkite jas į 100 μl tiesioginio augalo lizės buferio A ir kaitinkite 95°C temperatūroje 5–10 min.Sunkiai lizuojamiems lapams lizės laikas gali būti atitinkamai pratęstas (ne ilgiau kaip 30 min.).Pakaitinę, trumpai centrifuguokite ir į PGR sistemą įpilkite 1 μl supernatanto kaip reakcijos šablonąb.
a.Tinkamo dydžio pavyzdžiams pjauti taip pat galima naudoti žirkles ar kitus įrankius;jei perforatorius ar žirklės naudojami pakartotinai, prieš kiekvieną naudojimą juos reikia nuvalyti 2% natrio hipochlorito tirpalu, kad būtų išvengta kryžminio mėginių užteršimo.
b.Prieš naudodami įsitikinkite, kad tiesioginės augalų lizės buferis yra visiškai ištirpęs.Jei buferis yra klampus arba jame yra nuosėdų, prieš naudojimą jį galima pašildyti iki 37 ℃, kad jis visiškai ištirptų.
c.Šablono tūris reakcijos sistemoje gali būti atitinkamai sureguliuotas, atsižvelgiant į augalinės medžiagos ir pridėto skiediklio tūrio skirtumą.
Augalų tiesioginės lizės buferis
Šiame produkte esantis tiesioginės augalų lizės buferis A buvo griežtai optimizuotas, kad išlaisvintų daugumos augalų audinių genomą ir yra tinkamas trumpalaikiam neapdorotų augalų laikymui 4 ℃ temperatūroje.Jeigu mėginį reikia laikyti ilgesnį laiką (pvz., 1 – 2 mėnesius), supernatantą rekomenduojama perkelti į naują EP mėgintuvėlį ir laikyti -20 ℃ temperatūroje.Norėdami stabiliau laikyti mėginius, į perkeltą supernatantą įpilkite vienodo tūrio augalų tiesioginio lizės buferio B, gerai išmaišykite ir laikykite -20 ℃ temperatūroje.Stabilus laikymo laikas skiriasi priklausomai nuo augalų mėginių ir būsenų.
Reakcijos sistema
| ddH2O | Iki 20,0 µl | Iki 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| 1 gruntas (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| 2 gruntas (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Augalų lapų / neapdoroto ekstrakto pavyzdys(Žr. Mėginių apdorojimas) | 0,5–3 mm lapų diskas/x µl | 0,5–3 mm lapų diskas/x µl |
a.Jame yra Mg2+kai galutinė koncentracija yra 2 mM.
b.Kiekvienam gruntui rekomenduojama naudoti galutinę 0,4 μM koncentraciją.Pernelyg didelis pradmenų naudojimas padidins nespecifinį amplifikaciją.
c.Naudojamo mėginio kiekis gali būti koreguojamas pagal faktinę situaciją.Vienoje reakcijoje naudojamas neapdoroto lizuoto mėginio kiekis gali būti reguliuojamas nuo 2% iki 20% viso reakcijos tūrio.Naudojant per daug mėginių, gali sugesti stiprinimas.
Reakcijos programa
| Žingsniai | Temperatūra | Laikas |
| Pradinė denatūracija | 98 ℃ | 5 min |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 10 sek |
| Atkaitinimas | 58-72 ℃ | 15 sek |
| Pratęsimas | 72 ℃ | 30 sek |
| Galutinis pratęsimas | 72 ℃ | 5 min |
a.Pradinė denatūracija (98 ℃, 5 min.) skatina augalų audinių lizę, atpalaiduoja genominę DNR, kuri gali būti naudojama PGR amplifikacijai.Netrumpinkite laiko ir nemažinkite temperatūros.
b.Rekomenduojama nustatyti, kad jis būtų lygus pradmenų Tm vertei arba 2 ~ 4 ℃ didesnis nei Tm reikšmė.Šiame gaminyje naudojama tiesioginio amplifikacijos DNR polimerazė skiriasi nuo įprastos Taq DNR polimerazės ir turi specialius reikalavimus reakcijos atkaitinimo temperatūrai ； Aukštos atkaitinimo temperatūros naudojimas gali veiksmingai sumažinti nespecifinį amplifikaciją ir pagerinti amplifikacijos efektyvumą.Sudėtingiems šablonams efektyvų sustiprinimą galima pasiekti reguliuojant atkaitinimo temperatūrą ir pailginant pratęsimo laiką.
c.Jei amplifikacijos produkto ilgis yra ≤1 kb, pratęsimo laikas nustatomas 30 sek/kb;jei amplifikacijos produkto ilgis >1 kb, pratęsimo laikas nustatomas 60 sek/kb.
d.Sudėtingiems mėginiams arba mėginiams su maža amplifikacijos išeiga, ciklų skaičius gali būti atitinkamai padidintas iki 40–50 ciklų.
Programos
Jis tinka tiesioginiam augalų audinių amplifikavimui ir didelio našumo augalų mėginių, kuriuose nėra polisacharidų ir polifenolių, atrankai.
Pastabos
Tik moksliniams tyrimams.Nenaudoti diagnostikos procedūroms.
1. Neapdorotai augalų amplifikacijai arba tiesioginei amplifikacijai prieš pradedant eksperimentą rekomenduojama naudoti išgrynintą genominę DNR kaip teigiamą kontrolę, siekiant užtikrinti, kad sistema, pradmenys ir operacijos yra teisingi.
2. Šiame rinkinyje naudojama tiesioginės amplifikacijos DNR polimerazė pasižymi stipriu korektūros aktyvumu.Jei reikia atlikti TA klonavimą, prieš pridedant adenino, rekomenduojama išgryninti DNR.
3. Grunto projektavimo gairės:
a.Rekomenduojama, kad paskutinis pagrindas 3′ grunto gale būtų G arba C.
b.Reikėtų vengti nuoseklių neatitikimų paskutiniuose 8 bazėse 3′ grunto gale.c.Venkite plaukų segtukų struktūrų 3′ grunto gale.
d.Priekinio ir atvirkštinio pradmenų Tm reikšmių skirtumai turi būti ne didesni kaip 1 ℃, o Tm vertė turi būti sureguliuota iki 60 ~ 72 ℃ (Tm vertei apskaičiuoti rekomenduojama naudoti Primer Premier 5).
e.Apskaičiuojant pradmenų Tm reikšmę, neturėtų būti įtraukiamos papildomos papildomos pradmenų sekos, kurios neatitinka šablono.
f.Rekomenduojama, kad grunto GC kiekis būtų 40–60%.
g.Bendras A, G, C ir T pasiskirstymas grunte turi būti kuo tolygesnis.Nenaudokite regionų, kuriuose yra daug GC arba AT.
h.Venkite 5 ar daugiau bazių komplementarių sekų buvimo pradmenyje arba tarp dviejų pradmenų ir venkite 3 ar daugiau bazių komplementarių sekų buvimo dviejų pradmenų 3′ gale.
i.Naudokite NCBI BLAST funkciją, kad patikrintumėte pradmenų specifiškumą, kad išvengtumėte nespecifinio amplifikacijos.
