Proteinazė K mNGS (skysta)
Proteinazė K yra stabili serino proteazė, turinti platų substrato specifiškumą.Jis suardo daugelį natūralių baltymų net ir naudojant ploviklius.Kristalų ir molekulinės struktūros tyrimų duomenys rodo, kad fermentas priklauso subtilzinų šeimai, turinčiai aktyvios vietos katalizinę triadą (Asp39- Jo69- Ser224).Vyraujanti skilimo vieta yra peptidinė jungtis, esanti šalia alifatinių ir aromatinių aminorūgščių karboksilo grupės su blokuotomis alfa amino grupėmis.Jis dažniausiai naudojamas dėl plataus specifiškumo.Ši proteinazė K yra specialiai sukurta mNGS.Palyginti su kita proteinaze K, jame yra dar mažiau nukleino rūgščių užteršimo, turinčio tą patį fermentinį efektyvumą, o tai galėtų geriau užtikrinti mNGS naudojimą pasroviui.
Laikymo sąlygos
2-8 ℃ 2 metus
Specifikacija
| Išvaizda | Bespalvis arba šviesiai rudas skystis |
| Veikla | ≥800 V/ml |
| Baltymų koncentracija | ≥20 mg/ml |
| Nikasė | Niekas neaptiktas |
| DNazė | Niekas neaptiktas |
| RNazė | Niekas neaptiktas |
Savybės
| EB numeris | 3.4.21.64(Rekombinantinis iš Tritirachium albumo) |
| Izoelektrinis taškas | 7.81 |
| Optimalus pH | 7.0- 12.0 1 pav |
| Optimali temperatūra | 65 ℃ 2 pav |
| pH stabilumas | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 val.) 3 pav. |
| Šiluminis stabilumas | Žemesnė nei 50 ℃ (pH 8,0, 30 min.) 4 pav |
| Sandėliavimo stabilumas | Daugiau nei 90% aktyvumo 12 mėnesių 25 ℃ temperatūroje |
| Aktyvatoriai | SDS, karbamidas |
| Inhibitoriai | Diizopropilo fluorofosfatas;fenilmetilsulfonilfluoridas |
Programos
1. Genetinės diagnostikos rinkinys
2. RNR ir DNR ekstrahavimo rinkiniai
3. Nebaltyminių komponentų išskyrimas iš audinių, baltyminių priemaišų, pvz., DNR, skaidymasvakcinos ir heparino paruošimas
4. Chromosomų DNR paruošimas impulsine elektroforeze
5. Western blot
6. Fermentinių glikozilinto albumino reagentų diagnostika in vitro
Atsargumo priemonės
Naudodami ar sverdami mūvėkite apsaugines pirštines ir akinius, o po naudojimo gerai vėdinkite.Šis produktas gali sukelti alerginę odos reakciją ir stiprų akių dirginimą.Įkvėptas gali sukelti alergijos ar astmos simptomus arba dusulį.Gali dirginti kvėpavimo takus.
Vieneto apibrėžimas
Vienas vienetas (U) apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas kazeinui hidrolizuoti, kad susidarytų 1 μmoltirozino per minutę tokiomis sąlygomis.
Reagentų paruošimas
Reagentas I: 1 g pieno kazeino ištirpinamas 50 ml 0,1 M natrio fosfato tirpalo (pH 8,0), inkubuojamas 65-70 ℃ vandenyje 15 min., maišomas ir ištirpinamas, atšaldomas vandeniu, natrio hidroksidu reguliuojamas pH iki 8,0 ir nustatytas tūris. 100 ml.
Reagentas II: 0,1 M trichloracto rūgštis, 0,2 M natrio acetatas, 0,3 M acto rūgštis.
Reagentas III: 0,4 M Na2CO3sprendimas.
Reagentas IV: Forinto reagentas, praskiestas grynu vandeniu 5 kartus.
V reagentas: fermentų skiediklis: 0,1 M natrio fosfato tirpalas (pH 8,0).
Reagentas VI: tirozino tirpalas: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozino, ištirpinto 0,2M HCl.
Procedūra
1. 0,5 ml reagento I iš anksto pašildomas iki 37 ℃, įpilama 0,5 ml fermento tirpalo, gerai išmaišoma ir inkubuojama37 ℃ 10 min.
2. Įpilkite 1 ml reagento II, kad sustabdytumėte reakciją, gerai išmaišykite ir tęskite inkubaciją 30 min.
3. Centrifuguokite reakcijos tirpalą.
4. Paimkite 0,5 ml supernatanto, įpilkite 2,5 ml reagento III, 0,5 ml reagento IV, gerai išmaišykite ir inkubuokite 37 ℃ temperatūroje.30 min.
5. OD660buvo nustatytas kaip OD1;tuščioji kontrolinė grupė: 0,5 ml reagento V naudojamas fermentui pakeistisprendimas OD nustatyti660kaip OD2, ΔOD = OD1-OD2.
6. L-tirozino standartinė kreivė: 0,5 ml skirtingos koncentracijos L-tirozino tirpalo, 2,5 ml reagento III, 0,5 ml reagento IV 5 ml centrifugos mėgintuvėlyje, inkubuoti 37 ℃ 30 min., nustatyti OD660esant skirtingoms L-tirozino koncentracijoms, gauta standartinė kreivė Y=kX+b, kur Y yra L-tirozino koncentracija, X yra OD600.
Skaičiavimas
2: bendras reakcijos tirpalo tūris (ml)
0,5: fermento tirpalo tūris (mL)
0,5: reakcijos skysčio tūris, naudojamas chromogeniniam nustatymui (ml)
10: reakcijos laikas (min.)
Df: Skiedimo kartotinis
C: fermentų koncentracija (mg/mL)
Nuorodos
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofizė.Res.Komun.(1971);44:513.
3. Hilzas, H.ir kt.,Euras.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrookas Jet al., Molekulinis klonavimas: laboratorijos vadovas, 2-asis leidimas, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figūros
Fig.1 Optimalus pH
100mM buferinis tirpalas:pH6,0-8,0, Na-fosfatas;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glicinas-NaOH. Fermentų koncentracija: 1 mg/mL
2 pav. Optimali temperatūra
Reakcija 20 mM K-fosfato buferyje pH 8,0.Fermentų koncentracija: 1 mg/mL
3 pav. pH Stabilumas
25 ℃, 16 h apdorojimas 50 mM buferiniu tirpalu: pH 4,5-5,5, Acetatas;pH 6,0-8,0, Na-fosfatas;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicinas-NaOH.Fermentų koncentracija: 1 mg/mL
4 pav. terminis stabilumas
30 min. apdorojimas 50 mM Tris-HCl buferiu, pH 8,0.Fermentų koncentracija: 1 mg/mL
5 pav. Sandėliavimas stability at 25℃
