5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Katės Nr.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) yra labai stabilus vieno mėgintuvėlio zondo pagrindu pagamintas mišinys, tinkamas vienos pakopos atvirkštinei transkripcijai ir kiekybinei PGR (qRT-PCR).Jis palaiko išankstinį gruntų ir zondų sumaišymą ir išlieka stabilus ilgai laikant žemoje temperatūroje.Tiriamas mėginys gali būti pridėtas tiesiogiai naudojant, be papildomos mėgintuvėlio atidarymo/pipetavimo operacijos.Šiame gaminyje yra komponentų, pvz., karšto paleidimo DNR polimerazė, M-MLV, karščiui labili uracilo DNR glikozilazė (TS-UNG), Rnazės inhibitorius, MgCl2, dNTP (su dUTP vietoj dTTP) ir stabilizatoriais.Naudojant genetiškai modifikuotą greitosios amplifikacijos atvirkštinę transkriptazę ir DNR polimerazę, PGR amplifikaciją galima atlikti per 20-40 minučių.Šis reagentas naudoja specialų buferį qPCR su mišriais antiinhibitorinio amplifikacijos fermento ir UNG fermento fermentais.Todėl jis gali gauti gerą tikslinių genų amplifikaciją ir užkirsti kelią klaidingai amplifikacijai, kurią sukelia PGR likutinė ir aerozolinė tarša.Šis reagentas yra suderinamas su dauguma fluorescencinių kiekybinių PGR prietaisų iš gamintojų, tokių kaip Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ir Roche.
Komponentas
1.25 × Neoscript Fast RTase / UNG mišinys
2.5 × Neoscript Fast RT premikso buferis (dUTP)
Laikymo sąlygos
Visi komponentai turi būti laikomi -20 ℃ temperatūroje ilgalaikiam saugojimui ir 4 ℃ iki 3 mėnesių.Po atšildymo kruopščiai išmaišykite ir prieš naudodami centrifuguokite.Venkite dažno užšalimo ir atšildymo.
qRT-PGR reakcijos sistemos paruošimas
| Komponentai | 25μLSistema | 50μLSistema | Galutinė koncentracija |
| 5 × Neoscript Fast RT premikso buferis (dUTP) | 5 μl | 10 μl | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase / UNG mišinys | 1 μl | 2 μl | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μl | 2 μl | 1× |
| Šablono RNRb | – | – | – |
| ddH2O | Iki 25 μl | Iki 50 μl | – |
1) a.Galutinė grunto koncentracija paprastai yra 0,2 μM.Siekiant geresnių rezultatų, pradmenų koncentracija gali būti optimizuota 0,2–1 μM diapazone.Paprastai zondo koncentraciją galima optimizuoti 0,1–0,3 μM diapazone.
2) b. Naudojant greitąją PGR procedūrą, padidinus pradmenų ir zondų koncentraciją, gali būti geresnių amplifikacijos rezultatų, todėl jų santykis turėtų būti atitinkamai optimizuotas.
3) Įvairių tipų mėginiuose yra skirtingi inhibitorių tipai ir kiekis bei tikslinio geno kopijų skaičius.Mėginio tūris turėtų būti vertinamas pagal faktinę būklę.Jei reikia, mėginį praskieskite vandeniu be nukleazės arba TE buferiu.
Reakcija Csąlygos
| Įprasta PGR procedūra | Greita PGR procedūra | ||||||
| Procedūra | Temp. | Laikas | Ciklas | Procedūra | Temp. | Laikas | Ciklas |
| Atvirkštinė transkripcija | 50 ℃ | 10-20 min | 1 | Atvirkštinė transkripcija | 50 ℃ | 5 min | 1 |
| Polimerazė Aktyvinimas | 95 ℃ | 1-5 min | 1 | Polimerazė Aktyvinimas | 95 ℃ | 30s | 1 |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denatūravimas | 95 ℃ | 1-3 sek | 40-50 |
| Atkaitinimas ir Pratęsimas | 56-64 ℃ | 20-60s | Atkaitinimas ir Pratęsimas | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kokybės kontrolė
1.Funkcijų aptikimas: qPCR jautrumas, specifiškumas ir pakartojamumas.
2.Nėra egzogeninės nukleazės aktyvumo: nėra išorinės endonukleazės ir egzonukleazės taršos.
Pastabos
1.Greitos DNR polimerazės amplifikacijos greitis yra ne mažesnis kaip 1 kb/10s.Skirtingi PGR prietaisai turi skirtingą šildymo ir vėsinimo greitį, temperatūros valdymo režimus ir šilumos laidumą, todėl labai svarbu optimizuoti pradmenų / zondo koncentraciją ir veikimo metodą kartu su specialiu greito PGR prietaisu.
2.Šis produktas yra plačiai pritaikomas ir tinka didelio jautrumo molekulinei diagnostikai.Trijų pakopų PGR metodas rekomenduojamas pradmenims, kurių atkaitinimo temperatūra yra žema, arba ilgų, daugiau nei 200 bp fragmentų amplifikacijai.
3.Kadangi skirtingi amplikonai turi skirtingą dUTP panaudojimo efektyvumą ir skirtingą jautrumą UNG, reagentai turėtų būti optimizuoti, jei naudojant UNG sistemą sumažėja aptikimo jautrumas.Jei reikia, susisiekite su mumis dėl techninės pagalbos.
4.Siekiant išvengti pernešamų PGR produktų amplifikacijos, amplifikacijai reikalinga speciali eksperimentinė zona ir pipetė.Dirbkite su pirštinėmis ir dažnai keiskite ir neatidarykite PGR vamzdelio po amplifikacijos.
