Hotstart Taq DNR polimerazė
Hot Start Taq DNR polimerazė (antikūnų modifikacija) yra karšto paleidimo termostabili DNR polimerazė iš Thermus aquaticus YT-1, kuri pasižymi 5′→3′ polimerazės aktyvumu ir 5′ atvartu endonukleazės aktyvumu.Karšta paleidimo Taq DNR polimerazė yra Taq DNR polimerazė, modifikuota termolabiaisiais Taq antikūnais.Antikūnų modifikavimas padidino PGR specifiškumą, jautrumą ir išeigą.
Komponentai
| Komponentas | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq buferis | 4 × 1 ml | 4 × 10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNR polimerazė (antikūnas modifikuotas) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Programos
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 esant 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolio, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 ir 50 % glicerolio.
Sandėliavimo būklė
Transportuoti žemesnėje nei 0°C temperatūroje ir laikyti -25°C~-15°C temperatūroje.
Vieneto apibrėžimas
Vienas vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris per 30 minučių 75 °C temperatūroje įtraukia 15 nmol dNTP į rūgštyje netirpią medžiagą.
Kokybės kontrolė
1.Endonnukleazės aktyvumas:Inkubuojant 20 U fermento su 4 μg pUC19 DNR 4 valandas 37 ℃ temperatūroje, DNR degradacija nebuvo aptinkama, kaip nustatyta gelio elektroforeze.
2.5 kb Lambda PGR:25 5 ng lambda DNR PGR amplifikacijos ciklai su 1,25 vienetų Taq DNR polimerazės, esant 200 µM dNTP ir 0,2 µM pradmenų, duoda laukiamą 5 kb produktą.
3.Egzonukleazės aktyvumas:Inkubuojant 50 µl reakciją, kurioje yra mažiausiai 12,5 U Taq DNR polimerazės su 10 nmol 5'-FAM oligonukleotido 30 minučių 37 ℃ temperatūroje, neaptinkamas skilimas.
4.RNazės veikla:Inkubuojant 10 µL reakciją, kurioje yra 20 U fermento, su 1 μg RNR nuorašų 2 valandas 37 °C temperatūroje, nebuvo aptinkamo RNR skilimo, kaip nustatyta gelio elektroforeze.
5.Šilumos inaktyvavimas:Nr.
Reakcijos sistema
| Komponentai | Apimtis |
| DNR šablonasa | neprivaloma |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μl |
| 10 μM atvirkštinis gruntas | 0,5 μl |
| dNTP mišinys (kiekvienas po 10 mM) | 0,5 μl |
| 5 × HC Taq buferis | 5 μl |
| Taq DNR polimerazėb(5 U/μL) | 0,125 μl |
| Vanduo be branduolių | Iki 25 μl |
Pastabos:
1) a.
| DNR | Suma |
| Genominis | 1 ng-1 μg |
| Plazmidė arba virusinė | 1 pg-1 ng |
2) b.Optimali Taq DNR polimerazės koncentracija gali svyruoti nuo 5-50 vienetų/mL (0,1-0,5 vienetų/25 µL reakcija) naudojant specializuotas programas.
Šiluminio dviračio protokolas
PGR
| Žingsnis | Temperatūra(°C) | Laikas | Ciklai |
| Pradinė denatūracijaa | 95 ℃ | 1-3 min | - |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 ciklai |
| Atkaitinimasb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Pratęsimas | 68 ℃ | 1kb/min | |
| Galutinis pratęsimas | 68 ℃ | 5 min | - |
Pastabos:
1) Daugeliui amplifikacijų pakanka pradinės 1 minutės denatūracijos 95 °C temperatūroje.Sudėtingiems šablonams rekomenduojama ilgiau denatūruoti 2–3 minutes 95°C temperatūroje.Atliekant kolonijų PGR, rekomenduojama pradinė 5 minučių denatūracija 95 °C temperatūroje.
2) Atkaitinimo etapas paprastai yra 15–60 s.Atkaitinimo temperatūra pagrįsta grunto poros Tm ir paprastai yra 45–68 ℃.
