Rnazės inhibitorius
Pelės RNazės inhibitorius yra rekombinantinis pelių RNazės inhibitorius, išreikštas ir išgrynintas iš E.coli.Jis jungiasi su RNaze A, B arba C santykiu 1:1 per nekovalentinį ryšį, taip slopindamas trijų fermentų aktyvumą ir apsaugodamas RNR nuo skilimo.Tačiau jis nėra veiksmingas prieš Aspergillus RNazę 1, RNazę T1, S1 Nukleazę, RNazę H arba Rnazę.Pelės RNazės inhibitorius buvo išbandytas RT-PGR, RT-qPCR ir IVT mRNR ir buvo suderinamas su įvairiomis komercinėmis atvirkštinėmis transkriptazėmis, DNR polimerazėmis ir RNR polimerazėmis.
Palyginti su žmogaus RNazės inhibitoriais, pelių RNazės inhibitorius neturi dviejų cisteinų, kurie būtų labai jautrūs oksidacijai, dėl kurios inhibitorius inaktyvuojamas.Dėl to jis stabilus esant mažoms DTT koncentracijoms (mažiau nei 1 mM).Dėl šios savybės jis tinkamas naudoti reakcijose, kuriose didelė DTT koncentracija yra neigiama reakcijai (pvz., Realaus laiko RT-PGR).
Ataikymas
Šis produktas gali būti plačiai naudojamas bet kokiame eksperimente, kuriame galima RNazės trukdžius, kad būtų išvengta RNR degradacijos, pavyzdžiui:
1.Pirmosios cDNR grandinės sintezė, RT-PGR, RT-qPCR ir kt.
2.Apsaugo RNR nuo degradacijos in vitro transkripcijos/transliacijos metu (pvz., viruso replikacijos sistema in vitro).
3.RNazės aktyvumo slopinimas RNR atskyrimo ir gryninimo metu.
Laikymo sąlygos
Produktas gali būti laikomas -25–15 ℃ temperatūroje, galioja 2 metus.
Saugojimo buferis
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT ir 50 % glicerolio.
Vieneto apibrėžimas
Pelės RNazės inhibitoriaus kiekis, reikalingas 5 ng ribonukleazės A aktyvumui slopinti 50%, buvo apibrėžtas kaip vienas vienetas (U).
Baltymų molekulinė masė
Pelės RNazės inhibitoriaus molekulinė masė yra 50 kDa.
Kokybės kontrolė
Egzonukleazė Veikla:
40 U pelių RNazės inhibitoriaus su 1 μg λ-Hind III virškinamos DNR 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesukelia skilimo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.
Endonukleazės aktyvumas:
40 U pelių RNazės inhibitoriaus su 1 μg λ DNR 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesuskaido, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.
Nikinimas Veikla:
40 V pelių RNazės inhibitoriaus su 1 μg pBR322 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesuskaido, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.
RNazė Veikla:
40 V pelių RNazės inhibitoriaus su 1,6 μg MS2 RNR 4 valandas 37 ℃ temperatūroje nesuskaido, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.
E.coli DNR:
40 U pelių RNazės inhibitoriaus patikrinama, ar nėra E. coli genominės DNR, naudojant TaqMan qPCR su pradmenimis, specifiniais E. coli 16S rRNR lokusui.E. coli genomo DNR užterštumas yra ≤ 0,1 pg/40 V.
Npastabas
1. Smarkus svyravimas arba maišymas sukels fermento inaktyvaciją.
2. Optimalus šio inhibitoriaus temperatūros diapazonas buvo 25–55 ℃, o jis buvo inaktyvuotas 65 ℃ ir aukštesnėje temperatūroje.
3. Pelės RNazės inhibitorius neslopino RNazės H, RNazės 1 ir RNazės T1 aktyvumo.
4. RNazės aktyvumo slopinimas nustatytas esant plačiam pH diapazonui (pH 5-9 buvo visi aktyvūs), o didžiausias aktyvumas buvo stebimas esant pH 7-8.
5. Kadangi ribonukleazės paprastai išlaiko aktyvumą denatūruojančiomis sąlygomis, reikia stengtis, kad RNazės inhibitorių molekulės, susidariusios komplekse su ribonukleaze, nedenatūruotų.Norint išvengti aktyvios ribonukleazės išsiskyrimo, reikia vengti aukštesnės nei 50 °C temperatūros ir didelės karbamido ar kitų denatūruojančių medžiagų koncentracijos.
