Laukinė Taq DNR polimerazė
Taq DNR polimerazė yra termostabili DNR polimerazė iš Thermus aquaticus YT-1, kuri pasižymi 5′→3′ polimerazės aktyvumu ir 5′ atvartu endonukleazės aktyvumu.
Komponentai
| Komponentas | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10 × Taq buferis | 2 × 1 ml | 2 × 10 ml | 2×50 ml | 5×200 ml |
| Taq DNR polimerazė (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Sandėliavimo būklė
Transportuoti žemesnėje nei 0°C temperatūroje ir laikyti -25°C~-15°C temperatūroje.
Vieneto apibrėžimas
Vienas vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris per 30 minučių 75 °C temperatūroje įtraukia 15 nmol dNTP į rūgštyje netirpią medžiagą.
Kokybės kontrolė
1.Baltymų grynumo tyrimas (SDS-PAGE):Taq DNR polimerazės grynumas buvo ≥95%, nustatytas SDS-PAGE analize.
2.Endonnukleazės aktyvumas:Mažiausiai 5 U Taq DNR polimerazės su 1 μg λDNR 16 valandų 37 ℃ temperatūroje neaptinkamo skilimo, kaip nustatyta.
3.Egzonukleazės aktyvumas:Mažiausiai 5 U Taq DNR polimerazės su 1 μg λ-Hind Ⅲ virškinamos DNR 16 valandų 37 ℃ temperatūroje neaptinkamo skilimo, kaip nustatyta.
4.Nikazės veikla:Mažiausiai 5 U Taq DNR polimerazės su 1 μg pBR322 DNR 16 valandų 37 °C temperatūroje neaptinkamo skilimo, kaip nustatyta.
5.RNazės veikla:Mažiausiai 5 U Taq DNR polimerazės su 1,6 μg MS2 RNR 16 valandų 37 °C temperatūroje neaptinkamo skilimo, kaip nustatyta.
6.E. coliDNR:5 U Taq DNR polimerazės patikrinama, ar nėra E. coli genominės DNR, naudojant TaqMan qPCR su pradmenimis, specifiniais E. coli 16S rRNR lokusui.E. coli genomo DNR užterštumas yra ≤1 kopija.
7.PGR amplifikacija (5,0 kb lambda DNR)- 50 µL reakcija, kurioje yra 5 ng lambda DNR su 5 vienetais Taq DNR polimerazės 25 PGR amplifikacijos ciklams, duoda laukiamą 5,0 kb produktą.
Reakcijos sąranka
| Komponentai | Apimtis |
| DNR šablonasa | neprivaloma |
| 10 μM Forward Primer | 1 μl |
| 10 μM atvirkštinis gruntas | 1 μl |
| dNTP mišinys (kiekvienas po 10 mM) | 1 μl |
| 10 × Taq buferis | 5 μl |
| Taq DNR polimerazėb | 0,25 μl |
| Vanduo be branduolių | Iki 50 μl |
Pastabos:
1) Skirtingų šablonų optimali reakcijos koncentracija yra skirtinga.Šioje lentelėje parodytas rekomenduojamas 50 µL reakcijos sistemos šablono naudojimas.
| DNR | Suma |
| Genominis | 1 ng-1 μg |
| Plazmidė arba virusinė | 1 pg-1 ng |
2) Optimali Taq DNR polimerazės koncentracija specializuotose srityse gali svyruoti nuo 0,25 µL ~ 1 µL.
ReakcijaPrograma
| Žingsnis | Temperatūra(°C) | Laikas | Ciklai |
| Pradinė denatūracijaa | 95 ℃ | 5 min | - |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 ciklai |
| Atkaitinimasb | 60 ℃ | 15 s | |
| Pratęsimas | 72 ℃ | 1kb/min | |
| Galutinis pratęsimas | 72 ℃ | 5 min | - |
Pastabos:
1) Pradinė denatūravimo sąlyga tinka daugeliui amplifikacijos reakcijų ir gali būti modifikuojama atsižvelgiant į šablono struktūros sudėtingumą.Jei šablono struktūra sudėtinga, išankstinio denatūravimo laikas gali būti pratęstas iki 5–10 minučių, kad būtų pagerintas pradinis denatūravimo efektas.
2) Atkaitinimo temperatūrą reikia reguliuoti pagal grunto Tm vertę, kuri paprastai nustatoma 3–5 ℃ žemesnė nei grunto Tm vertė;Sudėtingiems šablonams būtina reguliuoti atkaitinimo temperatūrą ir pratęsti pratęsimo laiką, kad būtų pasiektas efektyvus stiprinimas.
