Superstart qPCR Premix plus-UNG
Katės Nr.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG yra specializuotas reagentas, skirtas realaus laiko PGR kokybinėms ir kiekybinėms reakcijoms, naudojant zondu pagrįstą aptikimą, sukurtas specialiai liofilizacijos procesams.Jame yra naujas karšto paleidimo fermentas Hotstart Taq plus (DG), kurio Taq fermento aktyvumas yra uždarytas kambario temperatūroje, veiksmingai slopinantis nespecifinį amplifikaciją, atsirandančią dėl pradmenų nespecifinio atkaitinimo arba pradmenų dimero susidarymo žemos temperatūros sąlygomis, taip pagerindamas. amplifikacijos reakcijos specifiškumas.Šis reagentas naudoja optimizuotą qPCR specifinį buferį ir UNG/dUTP apsaugos nuo užteršimo sistemą, kad būtų pasiektas greitas karštas paleidimas, o tai žymiai pagerina qPCR reakcijų efektyvumą ir jautrumą.Jis gali gauti geras standartines kreives įvairiose kiekybinio nustatymo srityse ir tiksliai atlikti kiekybinį įvertinimą, veiksmingai užkertant kelią klaidingai teigiamai amplifikacijai, kurią sukelia likučiai PGR produktai arba aerozolio užterštumas.Šis reagentas yra suderinamas su dauguma fluorescencinių kiekybinių PGR prietaisų iš gamintojų, tokių kaip Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ir Roche ir kt., ir pasižymi geru stabilumu liofilizuota forma.
Reagento sudėtis
1. 5 × HotstartPremix plus-UNG (Mg2+nemokama) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4 × lioprotektorius (neprivaloma)
Laikymo sąlygos
Ilgalaikis saugojimas -20 ℃;4 ℃ temperatūroje galima laikyti iki 3 mėnesių.Prieš naudojimą gerai išmaišykite irvengti pakartotinio užšalimo ir atšildymo.
Dviračių protokolas
| Procedūra | Temp. | Laikas | Ciklas |
| Virškinimas | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polimerazės aktyvinimas | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denatūruoti | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Atkaitinimas ir pratęsimas | 56-64 ℃ | 20-60 s | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction Systiebo paruošimas
|
Sudėtis |
25 µl tūris |
50 µl tūris |
Galutinė koncentracija |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+nemokama) (DG) | 5 µl | 10 µl | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl | 0,9 µl | 4,5 mM |
| 4×lioprotektorius1 | 6,25 µl | 12,5 µl | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| DNR šablonas3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Iki 25 µl | Iki 50 µl | —— |
1. Galutinė 0,2 μM pradmenų koncentracija paprastai duoda gerų rezultatų;kai reakcijos efektyvumas prastas, prireikus pakoreguokite pradmenų koncentraciją 0,2–1 μM intervale.Zondo koncentracija paprastai optimizuojama 0,1–0,3 μM diapazone atliekant gradiento eksperimentus, siekiant rasti optimalius derinius.
2. Skirtingų tipų šablonuose esančių tikslinių genų kopijų skaičius skiriasi;jei reikia, norint nustatyti optimalų šablono pridėjimo kiekį, galima atlikti gradiento praskiedimą.
3. Šią sistemą galima liofilizuoti;kai klientai naudoja šią sistemą be šaldymo ir džiovinimo reikalavimų, galima pasirinktinai pridėti 4 × lioprotektorių; jei reikia liofilizuotų produktų, skystų reagentų etapo produkto veikimo patvirtinimo metu ji turi pridėti 4 × lioprotektorių, kad būtų užtikrintas nuoseklumas su liofilizuotos sistemos komponentais. ir efektus.
Kai sistema naudojamad džiovinimui šalčiu, paruoškite sistema as sekantis:
| Sudėtis | 25µL Reakcijos sistema |
| 5 × „HotstartPremix plus-UNG“ (Mg2+nemokama) (DG) | 5 µl |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl |
| 4×lioprotektorius | 6,25 µl |
| 25×Primer-Probe Mix | 1 µl |
| ddH2O | Iki 18-20 µl |
* Jei reikia kitų sistemų džiovinant šalčiu, pasikonsultuokite atskirai.
Liofilizacijos procedūrass
| Procedūra | Temp. | Laikas | Būklė | Spaudimas |
| Išankstinis užšaldymas | 4℃ | 30 min | Laikykis |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | Aušinimas | ||
| -50 ℃ | 180 min | Laikykis | ||
| Pirminis džiovinimas | -30 ℃ | 60 min | Šildymas |
Galutinis vakuumas |
| -30 ℃ | 70 min | Laikykis | ||
| Antrinis džiovinimas | 25℃ | 60 min | Šildymas |
Galutinis vakuumas |
| 25℃ | 300 min | Laikykis |
2. Aukščiau pateiktas liofilizacijos procesas skirtas tik nuorodai.Skirtingi gaminių tipai ir skirtingi šaldymo džiovintuvai turi skirtingus parametrus, todėl juos galima koreguoti pagal faktinius parametrussąlygos naudojimo metu.
3. Skirtingi liofilizavimo procesai gali būti tinkami skirtingų dydžių liofilizuotų produktų partijomsproduktų, todėl turi būti atliktas pakankamas bandymų patvirtinimas, kai jie naudojami didelio masto gamybai.
Liofilizo naudojimo instrukcijad milteliai
1. Trumpai centrifuguokite liofilizuotus miltelius;
2. Į liofilizuotus miltelius įpilkite nukleino rūgšties šablono ir įpilkite vandens iki 25 µL;
3. Gerai sumaišykite centrifuguodami ir paleiskite mašinoje.
Kokybės kontrolė:
1. Funkcinis testavimas: qPCR jautrumas, specifiškumas, atkuriamumas.
2. Jokio egzogeninio nukleazės aktyvumo, jokio egzogeninio endo/egzonukleazės užteršimo.
Technine informacija:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG naudoja naują karšto paleidimo fermentą, kuris leidžia greitai paleisti karštą paleidimą per 1–5 minutes;Dėl specialios buferinės formulės jis tinka daugybinėms fluorescencinėms kiekybinėms PGR reakcijoms.
2. Jis pasižymi didesniu specifiškumu, kuris žymiai pagerina fluorescencinės kiekybinės PGR ribos aptikimo jautrumą, normalizuoja amplifikacijos kreives, o fluorescencijos vertė akivaizdžiai pagerėja esant mažos koncentracijos šablonams, tinkami kaip didelio jautrumo fluorescenciniai kiekybiniai PGR aptikimo reagentai.
3. Pradedantiesiems su žemesne atkaitinimo temperatūra arba ilgesniais nei 200 bp fragmentais rekomenduojamas 3 pakopų metodas.
4. Skirtingiems tiksliniams genams dUTP panaudojimo efektyvumas ir jautrumas UNG fermentui skiriasi, todėl jei naudojant UNG sistemą sumažėja aptikimo jautrumas, reikia pakoreguoti ir optimizuoti reakcijos sistemą.Jei reikalinga techninė pagalba, susisiekite su mūsų įmone.
5. Prieš ir po stiprinimo naudokite tam skirtas vietas ir pipetes, darbo metu mūvėkite pirštines ir jas dažnai keiskite;Neatidarykite reakcijos mėgintuvėlio po PGR, kad sumažintumėte mėginių užteršimą PGR produktais.
