M-MLV atvirkštinė transkriptazė
RevScript Atvirkštinė transkriptazė gaunama genų inžinerijos technologija.Jis pasižymi didesniu cDNR sintezės gebėjimu, terminiu stabilumu ir reakcijos temperatūros riba (iki 60°C).Susintetintas cDNR produktas yra iki 10 kb.Jis padidina šablonų afinitetą ir yra tinkamas atvirkštinei RNR šablonų, turinčių sudėtingą antrinę struktūrą arba mažai kopijuotus genus, transkripcijai.
Komponentai
| Komponentas | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10 000 U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript atvirkštinė transkriptazė (200 U/μL) | 50 μl | 5×50 μl | 1 ml |
| 5 × RevScript buferis | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Sandėliavimo būklė
Šis produktas turi būti laikomas -25°C ~ -15°C temperatūroje 2 metus.
Vieneto apibrėžimas
Vienas vienetas į rūgštyje netirpią medžiagą įtraukia 1 nmol dTTP per 10 minučių 37 °C temperatūroje, naudojant Oligo(dT) kaip pradmenis.
Reakcijos sąranka
1.RNR šablono denatūravimas (šis žingsnis yra neprivalomas, RNR šablono denatūravimas padeda atverti antrines struktūras, o tai pagerins pirmosios grandinės cDNR išeigą.)
| Komponentai | Apimtis (μL) |
| Be RNazės ddH2O | Iki 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) arba Random Primer (50 μmol/L) Arba genų specifiniai pradmenys (2 μmol/L) | 1 |
| arba 1 | |
| arba 1 | |
| RNR šablonas | X a |
Pastabos:
1) a: Bendra RNR: 1-5 ug arba mRNR: 1-500 ng
2) Inkubuojama 65°C temperatūroje 5 minutes, po to nedelsiant perkeliama ant ledo, kad atvėstų 2 minutes.Trumpas centrifugavimas, kad surinktumėte reakcijos skystį, įpilkite atvirkštinės transkripcijos reakcijos tirpalo, kaip parodyta šioje lentelėje.Švelniai pipete sumaišykite.
1.Reakcijos mišinio paruošimas (20 μl tūrio)
| Komponentai | Apimtis (μL) |
| Ankstesnio žingsnio mišinys | 13 |
| 5 × Buferis | 4 |
| dNTP mišinys (10 nmol/l) | 1 |
| Atvirkštinė transkriptazė (200 U/μL) | 1 |
| Rnazės inhibitorius (40 V/μL) | 1 |
1.Atlikite reakciją tokiomis sąlygomis:
| Temperatūra (°C) | Laikas |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85 °Cc | 5 min |
Pastabos:
1) a.Inkubuoti 25 °C temperatūroje 5 minutes reikia tik naudojant atsitiktinius heksamerus.Praleiskite šį veiksmą, kai naudojate Oligo (dT)18arba Gene Specific Primer.
2) b.Rekomenduojama atvirkštinės transkripcijos temperatūra yra 42°C. Šablonams su sudėtingomis antrinėmis struktūromis arba dideliu GC kiekiu rekomenduojama pakelti reakcijos temperatūrą iki 50-55°C.
3) c.Kaitinama 85 °C temperatūroje 5 minutes, kad būtų inaktyvuota atvirkštinė transkriptazė.
4) Produktas gali būti tiesiogiai naudojamas PGR arba qPCR reakcijose arba laikomas -20 °C temperatūroje trumpalaikiam saugojimui.Produktus rekomenduojama išlyginti ir ilgai laikyti -80°C temperatūroje.Venkite dažno užšalimo ir atšildymo.
5) Produktas tinka vienpakopei RT-qPCR, rekomenduojama pridėti 10-20 U atvirkštinės transkriptazės kiekvienai 25 μL reakcijos sistemai arba palaipsniui didinti atvirkštinės transkriptazės kiekį, atsižvelgiant į faktinę situaciją.
Pastabos
1.Eksperimento vieta turi būti švari;Darbo metu reikia mūvėti švarias pirštines ir kaukes.Visos eksperimente naudojamos eksploatacinės medžiagos turi būti be RNazės, kad būtų išvengta užteršimo RNaze.
2.Visos procedūros turi būti atliekamos ant ledo, kad būtų išvengta RNR skilimo.
3.Norint užtikrinti aukštą atvirkštinės transkripcijos efektyvumą, rekomenduojami aukštos kokybės RNR mėginiai.
4.Šis produktas skirtas tik moksliniams tyrimams.
5.Dėl savo saugumo dirbkite su laboratoriniais chalatais ir vienkartinėmis pirštinėmis.
