Robustart Taq DNR polimerazė
Robustart Taq DNA polimerazė yra karšto paleidimo DNR polimerazė.Šis produktas gali ne tik geriau slopinti nespecifinę reakciją, kurią sukelia nespecifinis pradmenų susijungimas arba pradmenų agregacija PGR sistemos paruošimo ir amplifikacijos procese.Todėl jis turi puikų specifiškumą ir yra veiksmingesnis mažos koncentracijos šablonų amplifikacijai ir tinka multipleksuotai PGR amplifikacijos reakcijai.Be to, šis produktas yra labai gerai pritaikomas, o stabilius amplifikacijos rezultatus galima gauti įvairių tipų PGR reakcijose.
Komponentai
1.5 U/μL Robustart Taq DNR polimerazė
2.10 × PGR buferis II (be Mg²+) (pasirinktinai)
3.25 mM MgCl2(neprivaloma)
* 10 × PGR buferis II (be Mg²+) neturi dNTP ir Mg²+, pridėkite dNTP ir MgCl2ruošiant reakcijos sistemą.
Rekomenduojamos programos
1.Greitas stiprinimas.
2.Daugkartinis stiprinimas.
3.Tiesioginis kraujo, tamponų ir kitų mėginių amplifikavimas.
4.Kvėpavimo takų ligų nustatymas.
Sandėliavimo būklė
-20°C ilgalaikiam saugojimui, prieš naudojimą reikia gerai išmaišyti, vengti dažno užšalimo ir atšildymo.
*Jei po šaldymo atsiranda kritulių, tai normalu;prieš maišant ir naudojant rekomenduojama subalansuoti iki kambario temperatūros.
Vieneto apibrėžimas
Vienas aktyvus vienetas (U) apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris į rūgštyje netirpią medžiagą įtraukia 10 nmol dezoksiribonukleotido 74 °C temperatūroje 30 min., naudojant aktyvuotą lašišos spermos DNR kaip šabloną / pradmenį.
Kokybės kontrolė
1.SDS-PAGE elektroforezinis grynumas didesnis nei 98%.
2.Stiprinimo jautrumas, partijos valdymas, stabilumas.
3.Nėra egzogeninės nukleazės aktyvumo, nėra egzogeninės endonukleazės ar egzonukleazės užteršimo
Instrukcijos
Reakcijos sąranka
| Komponentai | Apimtis (μL) | Galutinė koncentracija |
| 10 × PGR buferis II (be Mg²+)a | 5 | 1× |
| dNTP (10 mM kiekvienas dNTP) | 1 | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 | 1-4 mM |
| Robustart Taq DNR polimerazė (5 U/μL) | 0,25-0,5 | 1,25–2,5 U |
| 25 × Grunto mišinysb | 2 | 1× |
| Šablonas | - | ＜ 1 μg/reakcija |
| ddH2O | Iki 50 | - |
Pastabos:
1) a.Buferyje nėra dNTP ir Mg²+, pridėkite dNTP ir MgCl2ruošiant reakcijos sistemą.
2) b.Jei naudojamas qPCR/qRT-PGR, į reakcijos sistemą reikia pridėti fluorescencinių zondų.Paprastai 0,2 μM galutinė pradmenų koncentracija duos gerų rezultatų;jei reakcijos efektyvumas yra prastas, pradmenų koncentraciją galima reguliuoti 0,2-1 μM intervale.Zondo koncentracija paprastai optimizuojama 0,1–0,3 μM diapazone.Norint rasti geriausią pradmenų ir zondo derinį, galima atlikti koncentracijos gradiento eksperimentus.
Šiluminio dviračio protokolas
| Reguliarus PGRprocesas | |||
| Žingsnis | Temperatūra | Laikas | Ciklai |
| Išankstinė denatūracija | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 10-20 sek | 40-50 |
| Atkaitinimas / pratęsimas | 56-64 ℃ | 20-60 sek | |
| Greitas PGRprocesas | |||
| Žingsnis | Temperatūra | Laikas | Ciklai |
| Išankstinė denatūracija | 95 ℃ | 30 sek | 1 |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 1-5 sek | 40-45 |
| Atkaitinimas / pratęsimas | 56-64 ℃ | 5-20 sek | |
Pastabos
1.Greitos DNR polimerazės amplifikacijos greitis turi būti ne mažesnis kaip 1 kb/10 s.Įvairių PGR prietaisų temperatūros kilimo ir kritimo greitis, temperatūros valdymo režimas ir šilumos laidumo efektyvumas labai skiriasi, todėl rekomenduojama optimizuoti optimalias reakcijos sąlygas konkrečiam greito PGR prietaisui.
2.Sistema yra labai pritaikoma, pasižymi didesniu specifiškumu ir jautrumu.
3.Tinka naudoti kaip didelio jautrumo PGR aptikimo reagentai ir gali būti naudojami daugkartinėse PGR amplifikacijos reakcijose.
4.5′→3′ polimerazės aktyvumas, 5′→3′ egzonukleazės aktyvumas;nėra 3′→5′ egzonukleazės aktyvumo;nėra korektūros funkcijos.
5.Tinka kokybiniam ir kiekybiniam PGR ir RT-PGR tyrimui.
6.PGR produkto 3′ galas yra A, kuris gali būti tiesiogiai klonuotas į T vektorių.
7.Trijų etapų metodas rekomenduojamas pradmenims su žema atkaitinimo temperatūra arba ilgesnių nei 200 bp fragmentų amplifikacijai.
