2 × Sensi Direct Premix-UNG (zondas qPCR)
Katės Nr.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) sukurtas PGR atlikti tiesiogiai iš mėginių be DNR ekstrahavimo ar mėginio paruošimo.Šį reagentą sudaro karšto paleidimo DNR polimerazė, uracilo DNR glikozilazė (UNG), Rnazės inhibitorius, MgCl2, dNTP (su dUTP vietoj dTTP) ir stabilizatoriai, skirti kiekybiniam PGR (qPCR).Šis reagentas yra labai atsparus inhibitoriams, todėl jį galima tiesiogiai taikyti aptikti mėginius, tokius kaip gerklės tepinėlis, seilės, antikoaguliuotas visas kraujas, plazma ir serumas be DNR ekstrahavimo.Reagentas naudoja patentuotą buferį qPCR su mišriais antiinhibitorinės DNR polimerazės ir UNG fermento fermentais.Todėl jis gali gauti gerą tikslinių genų amplifikaciją mėginiuose, kuriuose yra inhibitorių, ir slopinti klaidingai teigiamą amplifikaciją, kurią sukelia PGR likutinė ir aerozolinė tarša.Šis reagentas yra suderinamas su dauguma fluorescencinių kiekybinių PGR prietaisų, tokių kaip Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche ir pan.
Komponentai
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG mišinys
2. 2 × SensiDirect išankstinio mišinio buferis (dUTP)
Laikymo sąlygos
Visi komponentai turi būti laikomi -20 ℃ temperatūroje ilgalaikiam saugojimui ir 4 ℃ iki 3 mėnesių.Po atšildymo kruopščiai išmaišykite ir prieš naudodami centrifuguokite.Venkite dažno užšalimo ir atšildymo.
Dviračių protokolas
| Žingsnis | Temperatūra | Laikas | Ciklas |
| Virškinimas | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polimerazės aktyvinimas | 95 ℃ | 1-5min | 1 |
| Denatūruoti | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Atkaitinimas / pratęsimas | 56-64 ℃ | 20-60s |
Pipetavimo instrukcijos
| Reagentas | Apimtis per reakcija | Tūris vienai reakcijai | Galutinė koncentracija |
| 2 × SensiDirect išankstinio mišinio buferis (dUTP) | 12,5 µl | 25 µl | 1× |
| 50 × SensiDirect fermentų / UNG mišinys | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Pavyzdys3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Bendras tūris | 25 μl | 50 μl | - |
1. Galutinė grunto koncentracija paprastai yra 0,2 μM.Siekiant geresnių rezultatų, pradmenų koncentracija gali būti optimizuota 0,2–1 μM diapazone.
2. Paprastai zondo koncentraciją galima optimizuoti 0,1–0,3 μM diapazone.Optimali zondo koncentracija yra susijusi su realaus laiko PGR amplifikacijos prietaisu, zondo tipu ir fluorescencinės žymėjimo medžiagos tipu.Žr. prietaiso vadovą arba konkrečius kiekvieno fluorescencinio zondo reikalavimus.
3. Įvairių tipų mėginiuose yra skirtingi inhibitorių tipai ir kiekis bei tikslinio geno kopijų skaičius.Mėginio tūris turėtų būti vertinamas pagal faktinę būklę.Jei reikia, atskieskite mėginį, pridedant vandens be nukleazės arba TE buferio.
4. Rekomenduojamas skirtingų mėginių tūris:
| Pavyzdys | Tūris vienam 50 μL reakcija | Maksimalus santykis |
| Antikoaguliuotas visas kraujas | 2,5 μl | 5% |
| Plazma | 15 μl | 30 % |
| Serumas | 10 μl | 20 % |
| Gerklės tepinėlis | 10 μl | 20 % |
| Seilės | 10 μl | 20 % |
Kokybės kontrolė
1. Funkcijų aptikimas: qPCR jautrumas, specifiškumas ir pakartojamumas.
2. Nėra egzogeninės nukleazės aktyvumo: nėra egzogeninės endonukleazės ir egzonukleazės taršos.
Produkto pastabos
1. Šiame gaminyje naudojama naujo tipo karšto paleidimo DNR polimerazė, kuri gali būti aktyvuota per 1-5 minutes. Kadangi jo reakcijos buferis buvo optimizuotas, jis labiau tinka dvigubai arba daugybinei fluorescencinei kiekybinei PGR, naudojant zondo metodą.
2. Jei PGR amplifikacijos Rn reikšmė yra per maža arba amplifikacija akivaizdžiai slopinama, mėginio kiekio sumažinimas, reakcijos tūrio padidinimas arba ankstesnis mėginio praskiedimas gali pagerinti rezultatus.
3. Kraujo, seilių, šlapimo, gerklės tepinėlių ir kt. paėmimas turi atitikti klinikinių kriterijų reikalavimus, o šviežias mėginys gali būti naudojamas siekiant užkirsti kelią nukleorūgščių skaidymui.
4. Kadangi skirtingų amplikonų panaudojimo efektyvumas skiriasi nuo dUTP ir jautrumas UNG, reagentai turi būti optimizuoti, jei naudojant UNG sistemą sumažėja aptikimo jautrumas.Jei reikia, susisiekite su mumis dėl techninės pagalbos.
5. Siekiant išvengti pernešamų PGR produktų amplifikacijos tarp vienos pakopos reakcijų, amplifikacijai reikalinga speciali eksperimentinė zona ir pipetė.Dirbkite su pirštinėmis ir dažnai keiskite ir neatidarykite reakcijos vamzdelio po PGR amplifikacijos.
