Uracilo DNR glikozilazė
Uracil-DNR glikozilazė (UNG arba UDG) yra rekombinantinis E.coli klonas, kurio molekulinė masė yra 25 kDa.Jis katalizuoja laisvo uracilo išsiskyrimą iš uracilo turinčios viengrandės ir dvigrandės DNR, yra neaktyvus prieš RNR ir gali būti naudojamas siekiant užkirsti kelią PGR amplifikacijos produktų užteršimui.Veikimo principas pagrįstas tuo, kad jei PGR reakcijoje dTTP pakeičiamas dUTP ir susidaro PGR amplifikacijos produktas, turintis dU bazių, fermentas gali selektyviai nutraukti U bazių glikozidinį ryšį viengrandėje ir dvigrandėje. DNR ir suardo PGR amplifikacijos produktą.
Rekomenduojama taikymas
Užteršimo prevencijos stiprinimas
Sandėliavimo būklė
-20°C ilgalaikiam saugojimui, prieš naudojimą reikia gerai išmaišyti, vengti dažno užšalimo ir atšildymo.
Saugojimo buferis
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizatorius, 50 % glicerolio.
Vieneto apibrėžimas
Fermento kiekis, reikalingas 1 µg vienos grandinės DNR, turinčios dU bazių, suskaidymui per 1 valandą 37 °C temperatūroje yra 1 vienetas.
Kokybės kontrolė
1.SDS-PAGE elektroforezinis grynumas didesnis nei 98 %
2.Stiprinimo jautrumas, partijos valdymas, stabilumas
3.Po to, kai 1 U UNG apdorojamas 50 ℃ temperatūroje 2 minutes, šablonas, kurio U yra mažesnis nei 103 kopijos, turėtų būti visiškai suskaidytas ir negali būti sukurtas joks stiprinimo produktas.
4.Nėra egzogeninio nukleazės aktyvumo
Instrukcijos
| Komponentai | Tūris (μL) | Galutinė koncentracija |
| 10 × PGR buferis (be dNTP, Mg²+Laisvas) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (pakeiskite dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1–0,5) | 0,25 U (0,1–0,5) |
| 25 × Grunto mišinysa | 2 | 1× |
| Šablonas | - | ＜1 μg / reakcija |
| ddH₂O | Iki 50 | - |
Pastaba: a: Jei naudojamas qPCR/qRT-PGR, fluorescencinis zondas turi būti įtrauktas į reakcijos sistemą.Paprastai 0,2 μM galutinė pradmenų koncentracija gali duoti gerų rezultatų;kai reakcijos efektyvumas yra prastas, pradmenų koncentracija gali būti reguliuojama 0,2-1 μM intervale.Paprastai zondo koncentracija optimizuojama 0,1–0,3 μM diapazone.Norint rasti geriausią pradmenų ir zondo derinį, galima atlikti koncentracijos gradiento eksperimentus.
Pastabos
1.UNG fermentas gali būti naudojamas pašalinti užterštus dUTP amplifikacijos produktus iš reakcijos sistemos prieš PGR amplifikacijos reakciją, tada siekiant išvengti klaidingai teigiamų rezultatų dėl produkto užteršimo.
2.Optimali UNG fermento temperatūra, naudojama priešužteršimo PGR reakcijoje, paprastai yra 50 ℃ 2 minutes;inaktyvavimo sąlyga yra 95 ℃ 5 minutes.
3.Venkite dažno užšalimo ir atšildymo ir saugokite nuo didelių temperatūros svyravimų.
4.Skirtingi amplifikuotini genai turi skirtingą dUTP panaudojimo efektyvumą ir jautrumą UNG fermentui, todėl, jei naudojant UNG sistemą sumažėja aptikimo jautrumas, reikia pakoreguoti ir optimizuoti reakcijos sistemą, jei reikia techninės pagalbos, kreipkitės į mūsų kompanija.
