M-MLV Neoscript atvirkštinė transkriptazė
Neoscript atvirkštinė transkriptazė yra atvirkštinė transkriptazė, gauta atliekant Moloney pelių leukemijos viruso kilmės M-MLV geno mutaciją ir ekspresiją E.coli.Fermentas pašalina RNazės H aktyvumą, turi aukštesnę temperatūros toleranciją ir yra tinkamas atvirkštinei transkripcijai aukštoje temperatūroje.Todėl jis padeda pašalinti neigiamą RNR aukšto lygio struktūros ir nespecifinių veiksnių poveikį cDNR sintezei, turi didesnį stabilumą ir atvirkštinės transkripcijos sintezės galimybes.Fermentas pasižymi didesniu stabilumu ir atvirkštinės transkripcijos sintezės gebėjimu.
Komponentai
1.200 U/μL Neoscript atvirkštinė transkriptazė
2.5 × pirmosios krypties buferis (pasirinktinai)
* 5 × pirmosios krypties buferyje nėra dNTP, paruošdami reakcijos sistemą, pridėkite dNTP
Rekomenduojama taikymas
1.Vieno etapo qRT-PGR.
2.RNR viruso aptikimas.
Sandėliavimo būklė
-20°C ilgalaikiam saugojimui, prieš naudojimą reikia gerai išmaišyti, vengti dažno užšalimo ir atšildymo.
Vieneto apibrėžimas
Viename vienete yra 1 nmol dTTP per 10 minučių 37 °C temperatūroje, naudojant poli(A)•oligo(dT)25kaip šablonas / gruntas.
Kokybės kontrolė
1.SDS-PAGE elektroforezinis grynumas didesnis nei 98%.
2.Stiprinimo jautrumas, partijos valdymas, stabilumas.
3.Nėra egzogeninės nukleazės aktyvumo, nėra egzogeninės endonukleazės ar egzonukleazės užteršimo
Pirmosios grandininės reakcijos sprendimo reakcijos sąranka
1.Reakcijos mišinio paruošimas
| Komponentai | Apimtis |
| Oligo (dT)12-18 Gruntas arba Random Primera Arba Genų specifiniai pradmenysb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Šablono RNR | Bendra RNR≤ 5μg;mRNR≤ 1 μg |
| DH be RNazės2O | Iki 10 μl |
Pastabos:a/b: Pasirinkite skirtingus pradmenų tipus pagal savo eksperimentinius poreikius.
2.Kaitinkite 65 °C temperatūroje 5 minutes ir greitai vėsinkite ant ledo 2 minutes.
3.Į aukščiau pateiktą sistemą įpilkite šių komponentų iki 20 µL ir atsargiai išmaišykite:
| Komponentai | Apimtis (μL) |
| 5 × pirmosios krypties buferis | 4 |
| Neoscript atvirkštinė transkriptazė (200 U/μL) | 1 |
| Rnazės inhibitorius (40 V/μL) | 1 |
| DH be RNazės2O | Iki 20 μl |
4. Atlikite reakciją pagal šias sąlygas:
(1) Jei naudojamas Random Primer, reakcija turi būti vykdoma 25 ℃ temperatūroje 10 minučių, o po to 50 ℃ temperatūroje 30–60 minučių;
(2) Jei naudojamas Oligo dT arba specifiniai pradmenys, reakcija turi būti vykdoma 50 ℃ temperatūroje 30–60 min.
5.Kaitinkite 95 ℃ temperatūroje 5 minutes, kad suaktyvintumėte Neoscript atvirkštinę transkriptazę ir nutrauktumėte reakciją.
6.Atvirkštinės transkripcijos produktai gali būti naudojami tiesiogiai PGR reakcijoje ir fluorescencinės kiekybinės PGR reakcijos metu arba ilgą laiką laikomi -20 ℃ temperatūroje.
PGR Rveiksmas:
1.Reakcijos mišinio paruošimas
| Komponentai | Koncentracija |
| 10 × PGR buferis (be dNTP, be Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM kiekvienas dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNR polimerazė (5 U/μL) | 2-2,5 U |
| 1 gruntas (10 μM) | 0,2-1 μM |
| 2 gruntas (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Šablonasa | ≤10 % pirmosios grandininės reakcijos tirpalo (2 μL) |
| ddH2O | Iki 50 μl |
Pastabos:a: Jei pridedama per daug pirmosios grandinės reakcijos tirpalo, PGR reakcija gali būti slopinama.
2.PGR reakcijos procedūra
| Žingsnis | Temperatūra | Laikas | Ciklai |
| Išankstinė denatūracija | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denatūravimas | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Atkaitinimas | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Pratęsimas | 72 ℃ | 10-60 sek |
Pastabos
1.Tinka atvirkštinės transkripcijos temperatūros optimizavimui 42 ℃ ~ 55 ℃ diapazone.
2.Jis turi geresnį stabilumą, tinkamas aukštoje temperatūroje atvirkštinės transkripcijos amplifikacijai.Be to, jis yra palankus efektyviai praeiti per sudėtingas struktūrines RNR sritis.Be to, taitinka vienpakopiniam daugybiniam fluorescenciniam kiekybiniam RT-PGR aptikimui.
3.Geras suderinamumas su įvairiais PGR amplifikacijos fermentais ir tinka didelio jautrumo RT-PGR reakcijoms.
4.Tinka didelio jautrumo vienos pakopos fluorescencinei kiekybinei RT-PCR reakcijai, efektyviai pagerina mažos koncentracijos šablonų aptikimo greitį.
5.Tinka cDNA bibliotekos konstravimui.
