EndoFree Plasmid Maxi rinkinys

Laikymo sąlygos

RNaseA turėtų būti laikoma -30 ~ -15 ℃ temperatūroje ir gabenama ≤ 0 ℃ temperatūroje.

Endotoxin Scavenger galima laikyti 2 ~ 8 ℃ temperatūroje vieną mėnesį, -30 ~ -15 ℃ temperatūroje ilgalaikiam saugojimui.ir gabenamas ≤0 ℃ temperatūroje.

Kiti komponentai turi būti laikomi kambario temperatūroje (15 ~ 25 ℃) ir gabenami kambario temperatūroje.

Komponentai

RNaseA:10 mg/ml, naudojamas RNR pašalinti.

Buferis P1:bakterijų suspensijos buferį, prieš pirmą kartą naudodami įpilkite RNaseA į buferį P1.

Buferis P2:bakterijų lizės buferis (su SDS/NaOH).

Buferis P4:neutralizuojantis buferis.

Endotoksinų valiklis:efektyviai pašalina endotoksiną iš neapdorotos plazmidės ekstrakto.

Buferis PW:plovimo buferio, prieš pirmą naudojimą įpilkite nurodytą kiekį etanolio.

TB buferis:eliuavimo buferis.

FastPure DNA Maxi kolonos:plazmidės DNR adsorbcijos kolonėlės.

Surinkimo tūbelės 50 ml:filtrato surinkimo vamzdeliai.

Surinkimo vamzdelis be endotoksinų:plazmidės DNR surinkimo vamzdeliai.

Paruoštos medžiagos

Absoliutus etanolis, izopropanolis, 50 ml apvaliadugniai centrifugos mėgintuvėliai ir 50 ml be endotoksinųcentrifuginiai vamzdeliai.

Programos

Šis produktas tinkamas didelio masto plazmidžių ekstrakcijai iš 150-300 ml bakterijų tirpalokultivuojamas per naktį.

Eksperimento procesas

1. Paimkite 150–200 ml (ne daugiau kaip 300 ml) per naktį kultivuoto bakterijų tirpalo ir centrifuguokiteapie 11 000 aps./min (12 000 × g) 1 – 2 min.Išmeskite supernatantą ir surinkite bakterijas.

Δ Surinkus daugiau nei 50 ml bakterijų tirpalo, bakterijas galima surinkti įpilant bakterijų tirpalo, centrifuguojant, išmetant supernatantą ir atliekant kitus veiksmus tame pačiame 50 ml mėgintuvėlyje.

daug kartų.

2. Į centrifugą įpilkite 7,5 ml buferio P1 (patikrinkite, ar į buferį P1 nebuvo pridėta RNaseA).mėgintuvėlyje, kuriame yra bakterijų, ir gerai išmaišykite sūkuriu arba pipete.

Δ Visiškas bakterijų resuspendavimas šiame etape yra labai svarbus norint gauti derlių, o po pakartotinio suspensijos neturėtų likti bakterijų gumulėlių.Jei yra bakterijų gumulėlių, kurie nėra kruopščiai sumaišyti, tai turės įtakos lizei, todėl derlius ir grynumas bus mažas.Jei bakterijų tirpalo OD600 yra 0,65, ekstrahuojant iš 150 ml bakterijų tirpalo rekomenduojama naudoti 7,5 ml buferio P1;kai OD600 yra 0,75, reikia naudoti 8 ml buferio P1 ir atitinkamai pakeisti buferių P2 ir P4 tūrius.Jei bakterijų tirpalo tūris padidinamas iki 200 ml, rekomenduojamaproporcingai didinamas buferių P1, P2 ir P4 tūris.

3. Į bakterijų suspensiją iš 2 žingsnio įpilkite 7,5 ml buferio P2 ir švelniai maišykite aukštyn ir žemyn 6–8kartų ir inkubuoti kambario temperatūroje 4 – 5 min.

Δ Švelniai apverskite, kad gerai išmaišytumėte.Sūkurys sukels genominės DNR suskaidymą, todėl išskirtoje plazmidėje atsiras genomo DNR fragmentai.Šiuo metu tirpalas tampa klampus ir permatomas, o tai rodo, kad bakterijos buvo visiškai lizuotos.Trukmė neturi viršyti 5 min., kad būtų išvengta plazmidžių sunaikinimo.Jei tirpalas nėra skaidrus, gali atsirasti per daug bakterijųnebaigta lizė, todėl bakterijų kiekį reikia atitinkamai sumažinti.

4. Įpilkite 7,5 ml buferio P4 į bakterijų suspensiją iš 3 žingsnio ir nedelsdami švelniai apverskite 6–8 kartus, kad tirpalas visiškai neutralizuotų buferį P2.Šiuo metu turėtų pasirodyti baltos flokuliuojančios nuosėdos.Centrifuguokite daugiau nei maždaug 11 000 aps./min (12 000 × g) 10–15 min., atsargiai pipete supilkite supernatantą į naują 50 ml apvaliadugnį centrifugos mėgintuvėlį (savarankiškai paruoštą) ir venkiteišsiurbti plaukiojančias baltas nuosėdas.

Δ Įpilkite buferio P4 ir nedelsdami apverskite, kad gerai išmaišytumėte.Palikite mėgintuvėlį stovėti, kol baltos nuosėdos tolygiai pasiskirstys tirpale, kad nesusidarytų vietinių nuosėdų, galinčių turėti įtakos neutralizavimui.Jei prieš centrifugavimą nėra vienodų baltų flokuliuojančių nuosėdų, o supernatantas po centrifugavimo nėra skaidrus, mėgintuvėlį galimacentrifuguojama dar 5 min.

5. Į 4 žingsnyje esantį supernatantą įpilkite 0,1 karto didesnio tūrio (10 % supernatanto tūrio, apie 2,2 ml) Endotoxin Scavenger ir apverskite, kad sumaišytumėte.Įdėkite tirpalą į ledo vonią arba įdėkite į susmulkintą ledą (arba šaldytuvo šaldiklį) 5 minutėms, kol tirpalas iš drumzlino pasikeis į skaidrus ir skaidrus (arba nejudėdamas).šiek tiek drumstas) ir retkarčiais keletą kartų pamaišykite.

Δ Į supernatantą įdėjus Endotoksinų valiklio, supernatantas taps drumstas, betsupernatantas turi tapti skaidrus (arba šiek tiek drumstas) po aušinimo ledo vonioje.

6. Kai supernatantas bus laikomas kambario temperatūroje (>25 ℃) 10–15 min., jis taps drumstas.jo temperatūra pakyla iki kambario temperatūros.Tada supernatantas turi būti apverstas, kad susimaišytų.

Δ Jei kambario temperatūra žemesnė arba norite sutrumpinti ekstrahavimo laiką, supernatantą galima inkubuoti 37–42 ℃ vandens vonioje 5–10 min., o kitą veiksmą galima atlikti po supernatanto.tampa drumstas.

7. Centrifuguokite supernatantą maždaug 11 000 aps./min (12 000 × g) 10 minučių kambario temperatūroje (temperatūra turi būti > 25 ℃), kad atskirtumėte fazę.Viršutinėje vandeninėje fazėje yra DNR, o apatiniame mėlynos aliejinės fazės sluoksnyje yra endotoksinų ir kitų priemaišų.PerkelkiteDNR turinčią vandeninę fazę į naują mėgintuvėlį irišmeskite riebų sluoksnį.

Δ Temperatūra centrifuguojant turi būti aukštesnė nei 25 ℃, nes efektyvus fazių atskyrimas to nedaroatsiranda, jei temperatūra yra per žema.

Δ Jei fazių atskyrimas neveiksmingas, centrifugavimo temperatūrą galima reguliuoti iki 30 ℃ ircentrifugavimo laikas gali būti padidintas iki 15 min.

Δ Nesiurbkite mėlyno riebaus sluoksnio, nes jame yra endotoksinų ir kitų priemaišų.

Mechanizmas

Resuspensijos lizės neutralizavimas

◇ Įpilkite 7,5 ml buferio P1

◇ Įpilkite 7,5 ml buferio P2

◇ Įpilkite 7,5 ml buferio P4

Endotoksinų pašalinimas

◇Įpilkite 0, 1 karto didesnį nei Endotoxin Scavenger supernatanto tūris

Įrišimas ir plovimas

◇ Įpilkite 0,5 karto daugiau izopropanolio

◇ Įpilkite 10 ml buferio PW