Vaccinia virusą stabdantis fermentas

Vaccinia viruso ribojimo fermentas yra gautas iš rekombinantinės E. coli padermės, turinčios Vaccinia ribojimo fermento genus.Šis vienas fermentas susideda iš dviejų subvienetų (D1 ir D12) ir turi tris fermentinius aktyvumus (D1 subvieneto RNR trifosfatazę ir guaniltransferazę ir D12 subvieneto guanino metiltransferazę).Vaccinia virus Capping Enzyme yra veiksmingas katalizuojantis dangtelio struktūros susidarymą, kuris gali konkrečiai pritvirtinti 7-metilguanilato dangtelio struktūrą (m7Gppp, Cap 0) prie 5′ RNR galo.Dangtelio struktūra (Cap 0) vaidina svarbų vaidmenį stabilizuojant mRNR, transportuojant ir transliuojant eukariotus.RNR uždengimas fermentine reakcija yra veiksmingas ir paprastas metodas, galintis žymiai pagerinti RNR stabilumą ir transliaciją in vitro transkripcijai, transfekcijai ir mikroinjekcijai.

Komponentai

Vaccinia viruso ribojimo fermentas (10 V/μL)

10 × ribojimo buferis

Laikymo sąlygos

-25～- 15 ℃ saugojimui (Venkite pasikartojančių užšaldymo ir atšildymo ciklų)

Saugojimo buferis

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glicerolio.

Vieneto apibrėžimas

Vienas Vaccinia virus Capping Enzyme vienetas yra apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas 10 pmol GTP įtraukti į 80nt transkriptą per 1 valandą esant 37 °C temperatūrai.

Kokybės kontrolė

Egzonukleazė:10 U Vaccinia viruso dangtelio fermento su 1 μg λ-Hind III virškinamos DNR 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesukelia skilimo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

Endonukleazė:10 U Vaccinia viruso dangtelio fermento su 1 μg λDNR 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesuskaido, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

Nikasė:10 U Vaccinia viruso dangtelio fermento su 1 μg pBR322 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesuskaido, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

RNazė:10 U Vaccinia virus Capping Enzyme su 1,6 μg MS2 RNR 4 valandas esant 37 ℃ nesukelia skilimo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

1.coli DNR:10 U Vaccinia virus Capping Enzyme patikrinama, ar nėra E. coli genominės DNR, naudojant TaqMan qPCR su pradmenimis, specifiniais E. coli 16S rRNR lokusui.E. coli genomo DNR užterštumas yra ≤1 E. coli genomas.

2.Bakterinė Endotoksinas: LAL testas, pagal Kinijos farmakopėjos IV 2020 leidimą, gelio ribos tyrimo metodas, bendroji taisyklė (1143).Bakterijų endotoksinų kiekis turi būti ≤10 EU/mg.

Reakcijos sistema ir sąlygos

1. Uždengimo protokolas (reakcijos tūris: 20 μL)

Ši procedūra taikoma 10 μg RNR (≥100 nt) ribojimo reakcijai ir ją galima padidinti pagal eksperimentinius poreikius.

I) Sumaišykite 10 μg RNR ir H2O be nukleazės 1,5 ml mikrofugos mėgintuvėlyje iki galutinio 15,0 µL tūrio.*10 × uždarymo buferis: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) 5 minutes kaitinkite 65 ℃ temperatūroje, po to 5 minutes kaitinkite ledo vonioje.

3) Pridėkite šiuos komponentus nurodyta tvarka

*10 × uždarymo buferis: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubuokite 37 °C temperatūroje 30 minučių, RNR dabar yra uždengta ir paruošta tolesniam naudojimui.

2. 5′ gnybtas ženklinimo reakcija (reakcijos tūris: 20 μL)

Šis protokolas skirtas žymėti RNR, turinčią 5' trifosfato, ir jį galima padidinti pagal poreikius.Etiketės įterpimo efektyvumui įtakos turės molinis RNR: GTP santykis, taip pat GTP kiekis RNR mėginiuose.

1) Sumaišykite atitinkamą kiekį RNR ir H2O be nukleazės 1,5 ml mikrofugos mėgintuvėlyje iki galutinio 14,0 µL tūrio.

2) 5 minutes kaitinkite 65 ℃ temperatūroje, po to 5 minutes kaitinkite ledo vonioje.

3) Nurodyta tvarka pridėkite šiuos komponentus.

** GTP MIX reiškia GTP ir nedidelį skaičių žymeklių.Apie GTP koncentraciją žrprie 3 pastabos.

4) Inkubuokite 37 °C temperatūroje 30 minučių, RNR 5′ galas dabar yra paženklintas ir paruoštas pasroviui

Programos

1. mRNR uždengimas prieš transliacijos tyrimus/transliaciją in vitro

2. iRNR 5' galo žymėjimas

Pastabos apie naudojimą

1.RNR tirpalo kaitinimas prieš inkubaciją su Vaccinia Capping Enzyme pašalina antrinę struktūrą 5' nuorašo gale.Pailginkite laiką iki 60 minučių nuorašams, kurių 5 colių galai žinomi.

2. Uždengimo reakcijoms naudojama RNR prieš naudojimą turi būti išgryninta ir suspenduota vandenyje be nukleazių.EDTA neturi būti, o tirpale neturi būti druskų.

3. Norint pažymėti 5' galą, bendra GTP koncentracija turi būti maždaug 1-3 kartus didesnė už mRNR molinę koncentraciją reakcijoje.

4. Reakcijos sistemos tūris gali būti padidintas arba sumažintas pagal faktinį.