PNGazė F
Peptidas-N-glikozidazė F (PNGazė F) yra veiksmingiausias fermentinis metodas, leidžiantis pašalinti beveik visus su N susijusius oligosacharidus iš glikoproteinų.PNGazė F yra amidazė, kuri suskaido tarp vidinių GlcNAc ir asparagino liekanų, turinčių daug manozės, hibridinių ir sudėtingų oligosacharidų iš N-sujungtų glikoproteinų.
Taikymas
Šis fermentas yra naudingas angliavandenių likučiams pašalinti iš baltymų.
Paruošimas ir specifikacija
| Išvaizda | Bespalvis skystis |
| Baltymų grynumas | ≥95 % (iš SDS-PAGE) |
| Veikla | ≥500 000 V/mL |
| Egzoglikozidazė | Nepavyko aptikti jokios veiklos (ND) |
| Endoglikozidazė F1 | ND |
| Endoglikozidazė F2 | ND |
| Endoglikozidazė F3 | ND |
| Endoglikozidazė H | ND |
| Proteazė | ND |
Savybės
| EB numeris | 3.5.1.52(Rekombinantas iš mikroorganizmo) |
| Molekulinė masė | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrinis taškas | 8. 14 |
| Optimalus pH | 7,0-8,0 |
| Optimali temperatūra | 65 °C |
| Substrato specifiškumas | Glikozidinių ryšių skilimas tarp GlcNAc ir asparagino liekanų 1 pav. |
| Atpažinimo svetainės | N prijungti glikanai, nebent juose būtų α1-3 fukozės 2 pav |
| Aktyvatoriai | DTT |
| Inhibitorius | SDS |
| Laikymo temperatūra | -25 ~ -15 ℃ |
| Šilumos inaktyvavimas | 20 µL reakcijos mišinys, kuriame yra 1 µL PNGazės F, inaktyvuojamas 10 minučių inkubuojant 75 °C temperatūroje. |
1 pav. PNGazės F substrato specifiškumas
2 pav. PNGazės F atpažinimo vietos.
Kai vidinės GlcNAc liekanos yra susietos su α1-3 fukoze, PNGazė F negali išskaidyti su N susietų oligosacharidų iš glikoproteinų.Ši modifikacija būdinga augalams ir kai kuriems vabzdžių glikoproteinams.
Ckomponentai
|
| Komponentai | Koncentracija |
| 1 | PNGazė F | 50 µl |
| 2 | 10 × glikoproteinų denatūravimo buferis | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Vieneto apibrėžimas
Vienas vienetas (U) apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas pašalinti >95% angliavandenių iš 10 µg denatūruotos RNazės B per 1 valandą 37 °C temperatūroje, kai bendras reakcijos tūris yra 10 µL.
Reakcijos sąlygos
1. Ištirpinkite 1–20 µg glikoproteino dejonizuotame vandenyje, įpilkite 1 µl 10 × glikoproteinų denatūravimo buferio ir vandens (jei reikia), kad bendras reakcijos tūris būtų 10 µl.
2.Inkubuokite 100°C temperatūroje 10 min., atvėsinkite ant ledo.
3.Įpilkite 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ir sumaišykite.
4.Įpilkite 1–2 µl PNGazės F ir H2O (jei reikia), kad bendras reakcijos tūris būtų 20 µl, ir sumaišykite.
5.Reakciją inkubuokite 37 °C temperatūroje 60 min.
6.SDS-PAGE analizei arba HPLC analizei.
