mRNR Cap2'-O-metiltransferazė

mRNR Cap 2'-O-metiltransferazė buvo gauta iš rekombinantinės E. coli padermės, turinčios vakcinos mRNR Cap 2'-O-metiltransferazės geną.Šis fermentas prideda metilo grupę pirmojo nukleotido 2'-O padėtyje, esančiame greta dangtelio struktūros RNR 5' gale. Fermentas naudoja S-adenozilmetioniną (SAM) kaip metilo donorą, kad metiluotų uždengtą RNR (dangtelį). -0), todėl susidaro cap-1 struktūra.

Cap1 struktūra gali padidinti vertimo efektyvumą, pagerindama mRNR ekspresiją transfekcijos ir mikroinjekcijų eksperimentuose. Šiam fermentui kaip substratui reikalinga RNR su m7GpppN dangteliu.Jis negali naudoti RNR su pN, ppN, pppN arba GpppN 5' gale.Uždengta RNR gali būti paruošta naudojant in vitro transkripciją, naudojant cap analogą, arba naudojant fermentinį dangtelį naudojant Vaccinia dangtelio fermentą.

Komponentai

mRNR Cap 2´-O-metiltransferazė (50 V/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Sandėliavimas

-25 ～- 15 ℃ saugojimui (Venkite pasikartojančių užšaldymo ir atšildymo ciklų)

Saugojimo buferis

20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glicerolio.

Vieneto apibrėžimas

Vienas vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas metilinti 10 pmolių 80 nt RNR transkripto per 1 valandą 37 °C temperatūroje.

Kokybės kontrolės tyrimai

Egzonukleazė:50 U mRNR Cap 2´ -O-metiltransferazės su 1 μg λ-Hind III virškinamos DNR 37 ℃ temperatūroje 16 valandų neduoda skaidymo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

Endonukleazė: 50 U mRNR Cap 2´ -O-metiltransferazės su 1 μg λDNR 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesudaro skaidymo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

Nikasė: 50 U mRNR Cap 2´ -O-metiltransferazės su 1 μg pBR322 37 ℃ temperatūroje 16 valandų nesudaro skaidymo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

RNazė: 50 U mRNR Cap 2 ´ -O-metiltransferazės su 1,6 μg MS2 RNR 4 valandas 37 ℃ temperatūroje nesukelia skilimo, kaip nustatyta agarozės gelio elektroforeze.

E. coli DNR: 50 V mRNR Cap 2´ -O-metiltransferazės patikrinama, ar nėraE. coli genominė DNR naudojant TaqMan qPCR su pradmenimis, specifiniaisE. coli 16S rRNR lokusas.TheE. coli genomo DNR užterštumas yra =1E. coli genomo.

Bakterinė Endotoksinas: LAL testas, pagal Kinijos farmakopėjos IV 2020 leidimą, gelio ribos tyrimo metodas, bendroji taisyklė (1143).Bakterijų endotoksinų kiekis turėtų būti =10 EU/mg.

Reakcijos sistema ir sąlygos

1. 1,5 ml mikrofugos mėgintuvėlyje sumaišykite atitinkamą kiekį uždengtos RNR ir RNazės neturinčio H2O iki galutinio 16,0 µL tūrio.

2. Kaitinkite 65 ℃ temperatūroje 5 minutes, po to 5 minutes kaitinkite ledo vonioje.

3. Pridėkite toliau nurodytus komponentus nurodyta tvarka (Capped RNR metilinimui

mažiau nei 10

*10 × uždarymo reakcijos buferis: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubuokite 37 ℃ temperatūroje 1 valandą (rekomenduojama inkubuoti 2 valandas, jei tikslinis fragmentas yra mažesnis nei 200 nt).

Programos

Pagerinti mRNR ekspresiją mikroinjekcijų ir transfekcijos eksperimentų metu.

Pastabos apie naudojimą

1. Prieš reakciją RNR turi būti išgryninta ir ištirpinta vandenyje be nukleazių, visuose tirpaluose neturi būti EDTA ir jonų.

2. Prieš reakciją rekomenduojama mėginio RNR pašildyti 65 ℃ temperatūroje 5 min., kad būtų pašalinta antrinė struktūra 5' nuorašo gale.Jis gali būti pratęstas iki 10 minučių sudėtingai 5 ' terminalo struktūrai.