Dvigubos RNR (dsRNR) ELISA RINKINYS

Šis rinkinys yra su fermentais susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) sujungimas su biotino ir streptavidino sistema, skirtas kiekybiniam dsRNR, kurio ilgis didesnis nei 60 bazinių porų (bp), matavimas, neatsižvelgiant į seką.Plokštelė buvo iš anksto padengta anti-dsRNR antikūnu.dsRNR, esančios mėginyje, pridedama ir jungiasi su antikūnais, padengtais šulinėliais.Tada pridedamas biotinilintas anti-dsRNR antikūnas, kuris jungiasi su dsRNR mėginyje.Po plovimo pridedama HRP-Streptavidin ir jis prisijungia prie biotinilinto anti-dsRNR antikūno.Po inkubacijos neprisijungęs HRP-Streptavidinas nuplaunamas.Tada pridedamas TMB substrato tirpalas ir katalizuojamas HRP, kad susidarytų mėlynos spalvos produktas, kuris, pridėjus rūgštinio stabdymo tirpalo, pasikeitė į geltoną.Geltonos spalvos tankis yra proporcingas tiksliniam dsRNR kiekiui, užfiksuotam plokštelėje.Sugertis matuojama esant 450 nm.

Taikymas

Šis rinkinys skirtas kiekybiniam likutinės dsRNR matavimui.

Komplekto komponentai

Sandėliavimas ir stabilumas

1. Nenaudojamam rinkiniui: visą rinkinį galima laikyti 2–8 ℃ temperatūroje iki galiojimo laiko.Siekiant stabilumo, reikia vengti stiprios šviesos.

2. Naudotam rinkiniui: atidarius mikroplokštelę, nepanaudotus šulinukus uždenkite plokštelės sandarikliu ir grįžkite į folijos maišelį, kuriame yra sausiklio pakuotė, folijos maišelį užsandarinkite užtrauktuku ir kiek įmanoma greičiau grįžkite į 2–8 ℃ temperatūrą.Kiti reagentai turi būti grąžinti į 2–8 ℃ temperatūrą kuo greičiau po naudojimo.

Reikalingos, bet nepristatytos medžiagos

1. Mikroplokštelių skaitytuvas su 450±10nm filtru (geriau, jei gali aptikti esant 450 ir 650 nm bangos ilgiams).

2. Mikroplokštelių kratytuvas.

3. Antgaliai be RNazių ir centrifugos mėgintuvėliai.

Operacijos schema

Prieš tau pradedant

1. Prieš naudodami visus rinkinio komponentus ir mėginius pašildykite iki kambario temperatūros (18–25 ℃).Jei rinkinys nebus panaudotas vieną kartą, išimkite tik juosteles ir reagentus šiam eksperimentui, o likusias juosteles ir reagentus palikite reikiamos būklės.

2. Plovimo buferis: atskieskite 40 ml 20 kartų koncentruoto plovimo buferio su 760 ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens, kad gautumėte 800 ml 1 × plovimo buferio.

3. Standartas: prieš naudojimą pradinį tirpalą trumpai pasukite arba centrifuguokite.Keturių pateiktų standartų koncentracija yra 5 ng/μL.Naudojant UTP ir pUTP dsRNR standartus, pradinį tirpalą praskieskite iki 1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μL STE buferiu, kad nubrėžtumėte standartinę kreivę.N1-Me-pUTP dsRNR standartams pradinį tirpalą praskieskite iki 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL STE buferiu, kad nubrėžtumėte standartinę kreivę.5-OMe-UTP dsRNR standarto pradinį tirpalą praskieskite iki 4,2,1,0,5, 0,25,0,125, 0,0625, 0pg/μL STE buferiu, kad nubrėžtumėte standartinę kreivę.Rekomenduojame, kad etalonai būtų skiedžiami pagal šias diagramas:

4. Biotinilintas aptikimo antikūnas ir HRP-streptavidino darbinis tirpalas: prieš naudojimą pradinį tirpalą trumpai pasukite arba centrifuguokite.Praskieskite juos skiedimo buferiu iki darbinės koncentracijos.

5. TMB substate: išsiurbkite reikiamą tirpalo dozę sterilizuotais antgaliais ir daugiau nepilkite likusio tirpalo į buteliuką.TMB substratas yra jautrus šviesai, nelaikykite TMB substrato šviesoje ilgą laiką.

Naudojant protokolą

1. Nustatykite tyrimui reikalingą juostelių skaičių.Norėdami naudoti, įdėkite juosteles į rėmus.Likusios plokštelės juostelės, nenaudotos šiame tyrime, turi būti supakuotos į maišelį su sausikliu.Sandariai uždarykite maišelį, kad galėtumėte laikyti šaldytuve.

2. Į atitinkamas duobutes įpilkite po 100 μL standartinio, tuščiojo ir mėginių skiedimo.Uždenkite plokštelės sandarikliu.Inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje, purtydami 500 aps./min.Mėginiai turi būti atskiesti STE buferiu iki tinkamos koncentracijos, kad būtų galima tiksliai atlikti tyrimą.

3. Plovimo žingsnis: Išsiurbkite tirpalą ir nuplaukite 250 μL plovimo buferio į kiekvieną šulinėlį ir palikite pastovėti 30 sekundžių.Visiškai išmeskite plovimo buferį, užfiksuodami plokštelę ant sugeriančio popieriaus.Visiškai plauti 4 kartus.

4. Į kiekvieną duobutę įpilkite 100 μL biotinilinto aptikimo antikūnų darbinio tirpalo.Uždenkite plokštelės sandarikliu.Inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje, purtydami 500 aps./min.

5. Pakartokite plovimo veiksmą.

6. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 100 μL HRP-streptavidino darbinio tirpalo.Uždenkite plokštelės sandarikliu.Inkubuokite 30 minučių kambario temperatūroje, purtydami 500 aps./min.

7. Dar kartą pakartokite plovimo veiksmą.

8. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 100 μL TMB substrato tirpalo.Uždenkite plokštelės sandarikliu.Inkubuokite 30 min. kambario temperatūroje Saugokite nuo šviesos.Įpylus substrato tirpalo, skystis taps mėlynas.

9. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 μL stabdymo tirpalo.Įpylus stabdymo tirpalo, skystis taps geltonas.Tada paleiskite mikroplokštelių skaitytuvą ir nedelsdami atlikite matavimus esant 450 nm.

Rezultatų skaičiavimas

1. Suskaičiuokite kiekvieno etalono, kontrolinio ir mėginio pasikartojančių rodmenų vidurkį ir atimkite vidutinį nulinį standartinį optinį tankį.Sukurkite standartinę kreivę, kurios absorbcija vertikalioje (Y) ašyje ir dsRNR koncentracija horizontalioje (X) ašyje.

2. Skaičiavimą rekomenduojama atlikti su kompiuterine kreivių pritaikymo programine įranga, tokia kaip curve expert 1.3 arba ELISA Calc, naudojant 5 arba 4 parametrų nelinijinio pritaikymo modelį.

Spektaklis

1. Jautrumas:

apatinė aptikimo riba: ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNR), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNR).

apatinė kiekybinio nustatymo riba: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNR), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNR), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNR).

2. Tikslumas: vidinio tyrimo CV ≤10%, tarpinio tyrimo CV ≤10%

3. Atkūrimas: 80 % ~ 120 %

4. Tiesiškumas: 0,0156-0,5 pg/μL (skirta UTP-, pUTP-dsRNR) 0,0312-1 pg/μL (skirta N1-Me-pUTP dsRNR), 0,0625-1 pg/μL (skirta 5-OMe-UTP-dsRNR).

Svarstymai

1. TMB reakcijos temperatūra ir laikas yra labai svarbūs, prašome juos griežtai kontroliuoti pagal instrukcijas.

2. Norint pasiekti gerą tyrimo atkuriamumą ir jautrumą, būtina tinkamai nuplauti plokšteles, kad būtų pašalintas nesureagavusių reagentų perteklius.

3. Prieš naudojimą visi reagentai turi būti kruopščiai sumaišyti ir, kad mėginys ar reagentai neliktų gumulėlių.

4. Jei koncentruotame plovimo buferyje (20x) susidarė kristalų, pašildykite iki 37 ℃ ir švelniai maišykite, kol kristalai visiškai ištirps.

5. Venkite tirti mėginius, kuriuose yra natrio azido (NaN3), nes tai gali sunaikinti HRP aktyvumą, todėl dsRNR kiekis gali būti nepakankamai įvertintas.

6. Venkite užteršimo Rnaze tyrimo metu.

7. Standartas / mėginys, aptikimo antikūnas ir SA-HRP taip pat gali būti atliekami kambario temperatūroje nekratant, tačiau dėl to aptikimo jautrumas gali sumažėti vieną kartą.Tokiu atveju rekomenduojame UTP ir pUTP dsRNR standartus skiesti nuo 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNR standartus skiesti nuo 4pg/μL, o 5-OMe-UTP dsRNR standartą – nuo ​​8pg/μL.Be to, inkubuokite HRP-streptavidino darbinį tirpalą 60 minučių kambario temperatūroje.Nenaudokite kolbų kratytuvo, nes kolbų kratytuvas gali sukelti netikslų rezultatą.

Tipiškas rezultatas

1. Standartinės kreivės duomenys

2. Standartinės kreivės skaičiavimas

3. Įdėklo aptikimo diapazonas: 0,0312- 1pg/μL