DNR ekstrahavimo mini rinkinys
Šiame rinkinyje įdiegta optimizuota buferinė sistema ir silikagelio kolonėlės valymo technologija, kuri gali atgauti 70 bp – 20 kb DNR fragmentus iš įvairių koncentracijų TAE arba TBE agarozės gelio.DNR adsorbcijos kolonėlė gali specialiai adsorbuoti DNR esant daug druskos.Be to, rinkinys gali tiesiogiai išvalyti DNR fragmentus iš PGR produktų, fermentinių reakcijų sistemų arba kitais metodais gautų neapdorotų DNR produktų ir pašalinti priemaišas, tokias kaip baltymai, kiti organiniai junginiai, neorganinių druskų jonai ir oligonukleotidų pradmenys.Jis gali užtikrinti, kad valymas gali būti baigtas per 10–15 minučių.Išgryninta DNR gali būti tiesiogiai naudojama ligavimui, transformacijai, fermentų virškinimui, in vitro transkripcijai, PGR, sekos nustatymui, mikroinjekcijai ir kt.
Laikymo sąlygos
Laikyti -15 ~ -25 ℃ temperatūroje ir transportuoti kambario temperatūroje.
Komponentai
| Komponentai | (100 rxns) |
| Buferinis BVP | 80 ml |
| Buferis GW | 2 × 20 ml |
| Eliucijos buferis | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buferinis BVP:DNR surišimo buferis.
Buferis GW:plovimo buferis;prieš naudojimą įpilkite absoliutaus etanolio iki nurodyto tūrio ant buteliuko.
Eliucijos buferis:Eliucija.
„FastPure DNA Mini Columns-G“:DNR adsorbcijos kolonėlės.
Surinkimo tūbelės 2 ml:Surinkimo vamzdeliai filtratui.
Paruoštos medžiagos
1,5 ml sterilizuoti mėgintuvėliai, absoliutus etanolis ir izopropanolis (kai DNR fragmentas ≤100 bp, įpilkite 1 tūrį
izopropanolio iki 1 tūrio gelio), vandens vonioje.
Eksperimento procesas
Prieš naudojimą įpilkite 80 ml etanolio, kad praskiestumėte buferį GW, kaip nurodyta etiketėje, laikykite kambario temperatūroje.
Mechanizmas
1. PGR reakcijos tirpalas
Gelio ekstrahavimo schema: pridėkite vienodo tūrio buferinio GDP PGR reakcijos tirpalo atkūrimo schema:Įpilkite 5 kartus didesnį tūrio buferį
2. BVP Apskaičiuokite gelio tūrį (100 μl lygus 100 mg)
Ištirpinkite gelį
3. Įkaitinkite iki 50–55 laipsnių℃
4. Bind Wash
Įpilkite 300 μl buferinio BVP*
Įpilkite 700 μL buferio GW
Įpilkite 700 μL buferio GW
5. Elute
Įpilkite 20–30 μL eliuavimo buferio arba dejonizuoto vandens
Pastabos* PGR reakcijos skysčio atgavimas be šio etapo
Gelio ištraukimo programa
1. Po DNR elektroforezės DNR fragmentams frakcionuoti, UV šviesoje išpjaukite vieną DNR fragmento juostelę iš agarozės gelio.Rekomenduojama naudoti sugeriamąjį popierių, kad sugertumėte tariamą gelio drėgmę ir sumažintumėte gelio gabalėlio dydį, kiek įmanoma pašalindami papildomą agarozę.Pasverkite gelio gabalėlį (be mikrocentrifugos mėgintuvėlio), kad apskaičiuotumėte jo tūrį: 100 mg gelio gabalėlio tūris yra maždaug 100 μL, darant prielaidą, kad tankis yra 1 g/ml.
2. Įpilkite vienodo tūrio buferinio GDP, inkubuokite 50–55 ℃ temperatūroje 7–10 min. (pagal gelio dydį koreguokite inkubacijos laiką, kol gelis visiškai ištirps).Inkubacijos metu vamzdelį apverskite 2 kartus.
Δ 1–3 buferinio BVP tūrių pridėjimas neturės įtakos DNR atkūrimo efektyvumui.Jei išgautinas DNR fragmentas <100 bp, reikia pridėti 3 tūrius buferinio GDP;kai gelio gabalėlis visiškai ištirps, įpilkite 1 tūrį izopropanolio ir gerai išmaišykite, tada pereikite prie kito žingsnio.
3. Trumpai centrifuguokite, kad mėginys patektų į mėgintuvėlio dugną, įdėkite FastPure DNA Mini Columns-G į 2 ml surinkimo mėgintuvėlius, vieną kartą atsargiai perkelkite ne daugiau kaip 700 μl tirpalo.
laiko iki filtravimo kolonėlių, centrifuguokite 12 000 aps./min (13 800 X g) 30-60 sek.
4. Išmeskite filtratą ir į kolonėlę įpilkite 300 μL buferinio GDP, inkubuokite kambario temperatūroje 1 min., centrifuguokite 12 000 aps./min. (13 800 X g) 30-60 sek.
5. Išmeskite filtratą ir į kolonėlę įpilkite 700 μL buferio GW (patikrinkite, ar iš anksto buvo pridėta absoliutaus etanolio!), centrifuguokite 12 000 aps./min. (13 800 X g) 30-60 sek.
Δ Įdėkite buferio GW aplink adsorbcijos kolonėlės sienelę arba pridėkite buferio GW galinį dangtelį ir 2–3 kartus sumaišykite jį aukštyn kojomis, kad visiškai nuplautumėte druską, prilipusią prie vamzdelio sienelės.
6. Pakartokite 5 veiksmą.
Δ Du kartus praplovus buferiu GW, galima užtikrinti, kad druska būtų visiškai pašalinta ir pašalintas poveikis tolesniems eksperimentams.
7. Išmeskite filtratą ir centrifuguokite tuščią kolonėlę 12 000 aps./min (13 800 X g) 2 min.
8. Įdėkite kolonėlę į švarų 1,5 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį, į kolonėlės membranos centrą įpilkite 20–30 μL eliuavimo buferio, inkubuokite 2 min., tada centrifuguokite 12 000 aps./min. (13 800 X g) 1 min.Išmeskite kolonėlę, gautą DNR laikykite -20 °C temperatūroje.
Δ 8 etapo supernatanto perkėlimas į kolonėlę, kad vėl išplautų, ir eliuavimo buferio pašildymas iki 55 (kai DNR fragmentas >3 kb) gali padėti padidinti regeneravimo efektyvumą.
PGR produktų atkūrimo programa
Šis protokolas taikomas valant DNR fragmentus iš PGR produktų, fermentinės reakcijos sistemos ir kitų DNR neapdorotų produktų (įskaitant genetinę DNR).Šiuo tirpalu galima efektyviai pašalinti įvairius nukleotidus, pradmenis, pradmenų dimerus, druskų molekules, fermentus ir kitas priemaišas.
1. Trumpai centrifuguokite PGR produktus, fermentinės reakcijos tirpalą ir kitus neapdorotus DNR produktus.Pipete įvertinkite jų tūrį ir supilkite į sterilizuotą 1,5 ml arba 2 ml mėgintuvėlį.Įpilkite ddH2O, kol tūris pasieks 100 μL;o didelės koncentracijos genominės DNR praskiedimas iki 300 μL su ddH2O padės pagerinti atkūrimo efektyvumą.
2. Įpilkite 5 tūrius buferinio GDP, gerai išmaišykite apversdami arba sukdami.Jei dominantis DNR fragmentas >100 bp, reikia pridėti dar 1,5 tūrio (mėginiai + buferinis BVP) etanolio.
3. Įdėkite kolonėlę atgal į surinkimo mėgintuvėlį, perkelkite mišinį į kolonėlę, centrifuguokite 12 000 aps./min (13 800 ×g) 30–60 sek.Jei sumaišyto tirpalo tūris yra >700 µL, adsorbcijos kolonėlę sudėkite atgal į surinkimo mėgintuvėlį, likusį tirpalą perkelkite į adsorbcijos kolonėlę ir centrifuguokite 12 000 aps./min (13 800 × g) 30–60 sek.
4. Kitas veiksmas susijęs su 08-1/Gelio ekstrahavimo programos 5–8 žingsniais.
Programos
Įvairių koncentracijų TAE arba TBE agarozės gelis;PGR produktai, fermentinės reakcijos sistemos ar kiti neapdoroti DNR produktai, gauti įvairiais metodais.Atgauti fragmentai svyravo nuo70 bp - 20 kb.
Pastabos
Tik moksliniams tyrimams.Nenaudoti diagnostikos procedūroms.
1. Prieš naudojimą įpilkite 80 ml etanolio, kad praskiestumėte buferį GW, kaip nurodyta etiketėje, laikykite kambario temperatūroje.
2. Jei buferinį GDP lengva nusodinti laikant žemoje temperatūroje, prieš naudojimą jį galima tam tikrą laiką palaikyti kambario temperatūroje.Jei reikia, jį galima pašildyti 37 ℃ vandens vonioje, kol nuosėdos visiškai ištirps, o tada sumaišius galima naudoti.
3. Iš anksto nustatykite vandens vonios temperatūrą į 50 ~ 55 ℃.
4. 08-1/Gel ekstrahavimo programos 1 veiksme sumažinus gelio gabalėlio dydį žymiai sutrumpės tirpimo laikas ir padidės regeneravimo efektyvumas (linearizuota DNR lengvai hidrolizuojasi, kai ji nuolat veikiama aukštoje temperatūroje).Ilgą laiką nelaikykite DNR gelio UV spindulių, nes ultravioletiniai spinduliai gali pažeisti DNR.
5. Visiškai ištirpinkite gelį 08-1/Gelio ekstrahavimo programos 2 žingsnyje, kitaip bus rimtai paveiktas DNR atkūrimo efektyvumas.
6. Iš anksto pašildykite eliuavimo buferį arba ddH2O iki 55 ℃ – tai padeda pagerinti DNR eliuavimo efektyvumą.DNR rekomenduojama laikyti 2,5 mM Tris-HCl eliuente, pH 7,0 – 8,5.
